- 基因工程的基本操作程序
- 共6244题
在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因A控制合成的抗冻蛋白A有较好的应用价值，通过转基因技术获得抗寒能力提高的植株．回答有关问题：
（1）从深海鱼提取和纯化DNA时，选择NaCl溶液的合适浓度，利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中______的特性，达到分离目的，加入一定量可以进一步获得含杂质较少的DNA．
（2）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生末端．若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生黏性末端的限制酶．
（3）为了检测A基因转录的mRNA是否翻译成抗冻蛋白A，需从转基因生物提取______，用相应的抗体进行______．
（4）若要用动物细胞工程技术，制备抗A抗体的杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞按一定比例加入试管中，再加入诱导细胞融合．细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有，体系中出现多种类型细胞的原因是______．
正确答案
解：（1）利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中溶解度不同的特性，达到分离DNA的目的，根据DNA在冷酒精中凝集效果最佳，可以进一步获得含杂质较少的DNA．
（2）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生粘性末端或平末端，用同一种限制酶切割后产生的末端相同，可以直接相连．
（3）检测基因工程中目的基因表达产物，可以提取蛋白质，进行抗原抗体杂交．
（4）制备抗A抗体的杂交瘤细胞，应该用免疫的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，一般用灭活的密病毒做诱导剂．由于细胞融合是随机的，且融合率达不到100%，所以融合的细胞除了杂交瘤细胞外，还可能有B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞．
故答案为：
（1）溶解度不同 冷却酒精
（2）平 相同
（3）蛋白质 抗原抗体杂交
（4）聚乙二醇（PEG、灭活的病毒） B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100%
解析
解：（1）利用DNA和其它杂质在不同NaCl溶液中溶解度不同的特性，达到分离DNA的目的，根据DNA在冷酒精中凝集效果最佳，可以进一步获得含杂质较少的DNA．
（2）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生粘性末端或平末端，用同一种限制酶切割后产生的末端相同，可以直接相连．
（3）检测基因工程中目的基因表达产物，可以提取蛋白质，进行抗原抗体杂交．
（4）制备抗A抗体的杂交瘤细胞，应该用免疫的小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，一般用灭活的密病毒做诱导剂．由于细胞融合是随机的，且融合率达不到100%，所以融合的细胞除了杂交瘤细胞外，还可能有B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞．
故答案为：
（1）溶解度不同 冷却酒精
（2）平 相同
（3）蛋白质 抗原抗体杂交
（4）聚乙二醇（PEG、灭活的病毒） B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，且融合率达不到100%
基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术．“基因敲除细胞”的构建过程如下：
第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增．这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”．
第二步：构建基因表达载体．取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入新霉素抵抗基因等．由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样，将表达载体准确地带到靶基因的位置．
第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造．
第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选．
基本原理如图所示．
请根据上述资料，回答下列问题：
（1）在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成______，在这过程中所需要的工具酶是______．
（2）启动子的化学成分是______，它位于基因的首端，是______识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA．
（3）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是______，原因是______．一般可采用______技术将目的基因导入受体细胞．若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为______细胞．
（4）上述资料中新霉素抵抗基因的作用最可能是______．
（5）（3）中获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因？为什么？
（6）该项技术具有广阔的应用前景，请试举一例______．
正确答案
解：（1）基因工程的操作步骤：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达．因此，将目的基因导入受体细胞前应先完成基因表达载体的构建．该过程需要用到限制酶和DNA连接酶．
（2）启动子的化学成分是一段有特殊结构的 DNA 片段，它位于基因的首端，是RNA聚合酶 识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA．
（3）受精卵的全能性最高，因此要获得一只含目的基因的小鼠，常选择受精卵作为受体细胞；将目的基因导入动物受体细胞中一般采用显微注射法．将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即用氯化钙处理微生物细胞，使其成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态．
（4）上述资料中，neoR基因（新霉素抵抗基因）可作为标志基因，便于筛选．
（5）在形成生殖细胞时等位基因（目的基因和靶基因）会发生分离，因此（2）中获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代不都含该目的基因．
（6）该项技术具有广阔的应用前景，可用于基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等．
故答案为：
（1）表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶
（2）一段有特殊结构的 DNA 片段 RNA 聚合酶
（3）受精卵 动物受精卵具有全能性（动物不能象植物那样，利用一个除受精卵以外的独立的体细胞直接培养成完整的个体） 显微注射技术 感受态
（4）作为标记基因，便于筛选
（5）否 在形成生殖细胞时等位基因（目的基因和靶基因）会发生分离
（6）基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等
解析
解：（1）基因工程的操作步骤：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达．因此，将目的基因导入受体细胞前应先完成基因表达载体的构建．该过程需要用到限制酶和DNA连接酶．
（2）启动子的化学成分是一段有特殊结构的 DNA 片段，它位于基因的首端，是RNA聚合酶 识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA．
（3）受精卵的全能性最高，因此要获得一只含目的基因的小鼠，常选择受精卵作为受体细胞；将目的基因导入动物受体细胞中一般采用显微注射法．将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即用氯化钙处理微生物细胞，使其成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态．
（4）上述资料中，neoR基因（新霉素抵抗基因）可作为标志基因，便于筛选．
（5）在形成生殖细胞时等位基因（目的基因和靶基因）会发生分离，因此（2）中获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代不都含该目的基因．
（6）该项技术具有广阔的应用前景，可用于基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等．
故答案为：
（1）表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶
（2）一段有特殊结构的 DNA 片段 RNA 聚合酶
（3）受精卵 动物受精卵具有全能性（动物不能象植物那样，利用一个除受精卵以外的独立的体细胞直接培养成完整的个体） 显微注射技术 感受态
（4）作为标记基因，便于筛选
（5）否 在形成生殖细胞时等位基因（目的基因和靶基因）会发生分离
（6）基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等
利用转基因奶牛乳腺生物反应器可生产人的生长激素，根据图回答有关问题．
（1）基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有______、______以及标记基因等．
（2）在体外受精前，要对精子进行______处理，对于牛的精子常采用______．
（3）图中①过程常采用______，图中②过程的培养液成分比较复杂，除一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、______、氨基酸、核苷酸等成分，以及______等物质．
（4）早期胚胎发育到______才进行移植．
正确答案
解：（1）基因表达载体是由目的基因、启动子、终止子和标记基因构成的．
（2）在体外受精前，要对精子进行获能处理，对于牛的精子常采用化学诱导法（或化学法）．
（3）将目的基因导入受精卵细胞中常采用显微注射法，图中②过程的培养液成分比较复杂，除一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等成分，以及血清等物质．
（4）早期胚胎发育到桑椹胚或囊胚才进行移植．
故答案为：
（1）启动子 终止子
（2）获能 化学诱导法（或化学法）
（3）显微注射法 激素 血清
（4）桑椹胚或囊胚
解析
解：（1）基因表达载体是由目的基因、启动子、终止子和标记基因构成的．
（2）在体外受精前，要对精子进行获能处理，对于牛的精子常采用化学诱导法（或化学法）．
（3）将目的基因导入受精卵细胞中常采用显微注射法，图中②过程的培养液成分比较复杂，除一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等成分，以及血清等物质．
（4）早期胚胎发育到桑椹胚或囊胚才进行移植．
故答案为：
（1）启动子 终止子
（2）获能 化学诱导法（或化学法）
（3）显微注射法 激素 血清
（4）桑椹胚或囊胚
α1-抗胰蛋白缺乏症是一种在北美较为常见的单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡．对于该致病患者常可采用注射人α1-抗胰蛋白酶来缓解症状．
（1）图1表示获取人α1-抗胰蛋白酶基因的两种方法，请回答下列问题：
①a过程是在酶的作用下完成的，该酶的作用特点是______．
②c过程称为______，该过程需要的原料是______．
③要确定获得的基因是否是所需的目的基因，可以从分子水平______上利用______技术检测该基因的碱基序列．
（2）利用转基因技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人α1-抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更易获得这种酶，简要过程如图2．
①获得目的基因后，常利用______技术在体外将其大量扩增．
②载体上绿色荧光蛋白（GEP）基因的作用是便于______．基因表达载体d，除图中的标示部分外，还必须含有______．
③若要使转基因羊的后代均保持其特有的性状，理论上应选用______技术进行繁殖．
正确答案
解：（1）①目的基因的获取包括直接分离法和人工合成法，人工合成法又包括反转录法和化学合成法．方法1采用直接分离法获得目的基因，需要用限制性核酸内切酶将目的基因剪切下来，该酶的作用是能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开．
②方法2采用反转录法获取目的基因，b过程为DNA的转录，从细胞中获得mRNA，在体外通过逆转录以4种游离的脱氧核苷酸为原料来合成目的基因．
③要检测获得的基因是否是所需要的基因，分子水平上利用DNA分子杂交技术．
（2）①PCR技术可以在短时间内大量扩增目的基因．
②标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来．基因表达载体必须含有启动子、终止子、目的基因和标记基因．
③要使后代保持与亲本相同的性状，理论上应选用动物体细胞克隆或者核移植技术进行繁殖．
故答案为：
（1）①限制性核酸内切酶 识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
②逆（或反）转录 4种脱氧核苷酸
③DNA分子杂交
（2）①PCR
②筛选含有目的基因的受体细胞 启动子、终止子
③体细胞克隆或者核移植
解析
解：（1）①目的基因的获取包括直接分离法和人工合成法，人工合成法又包括反转录法和化学合成法．方法1采用直接分离法获得目的基因，需要用限制性核酸内切酶将目的基因剪切下来，该酶的作用是能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开．
②方法2采用反转录法获取目的基因，b过程为DNA的转录，从细胞中获得mRNA，在体外通过逆转录以4种游离的脱氧核苷酸为原料来合成目的基因．
③要检测获得的基因是否是所需要的基因，分子水平上利用DNA分子杂交技术．
（2）①PCR技术可以在短时间内大量扩增目的基因．
②标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来．基因表达载体必须含有启动子、终止子、目的基因和标记基因．
③要使后代保持与亲本相同的性状，理论上应选用动物体细胞克隆或者核移植技术进行繁殖．
故答案为：
（1）①限制性核酸内切酶 识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
②逆（或反）转录 4种脱氧核苷酸
③DNA分子杂交
（2）①PCR
②筛选含有目的基因的受体细胞 启动子、终止子
③体细胞克隆或者核移植
科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长．质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞．请据图作答：
（1）在构建基因表达载体时，可用一种或者多种限制酶进行切割．为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶______和______分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA和质粒进行切割，切割后产生的DNA片段分别为______种和______种．
（2）培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使基因表达载体Ⅰ中含有______作为标记基因．
（3）研究人员通常采用______法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内．通常采用______技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质．
（4）利用组织培养技术将导入含鱼的抗冻蛋白基因的番茄组织细胞培育成植株．图中②、③依次表示组织培养过程中番茄组织细胞的______、______过程．
（5）如果抗冻蛋白还需要改造才能符合人们的需要，这属于______工程的范畴．
正确答案
解：（1）在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段；而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段．
（2）能在含氨苄青霉素的培养基中细胞具有抗氨苄青霉素基因，故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因．
（3）将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法．通常采用抗原-抗体杂交技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质．
（4）植物组织形成愈伤组织的过程是脱分化，而愈伤组织经再分化形成胚状体．
（5）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．
故答案为：
（1）PstⅠ，SmaⅠ（顺序可调），4，2
（2）抗氨苄青霉素基因（ampr）
（3）农杆菌转化，抗原-抗体杂交
（4）脱分化，再分化
（5）蛋白质
解析
解：（1）在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段；而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段．
（2）能在含氨苄青霉素的培养基中细胞具有抗氨苄青霉素基因，故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因．
（3）将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法．通常采用抗原-抗体杂交技术，在分子水平检测目的基因是否翻译形成了相应的蛋白质．
（4）植物组织形成愈伤组织的过程是脱分化，而愈伤组织经再分化形成胚状体．
（5）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．
故答案为：
（1）PstⅠ，SmaⅠ（顺序可调），4，2
（2）抗氨苄青霉素基因（ampr）
（3）农杆菌转化，抗原-抗体杂交
（4）脱分化，再分化
（5）蛋白质
（1）基因工程的四个操作步骤是：目的基因的获取、______、______、目的基因的检测与表达．
（2）获取Bt毒蛋白基因的方法一般有直接分离法（鸟枪法）、______等．
（3）一个基因表达载体的组成有启动子、终止子、目的基因和______等．
（4）将目的基因导人受体细胞的方法很多，在该题中涉及到的方法是______．
（5）检测基因工程是否成功，在DNA水平上鉴定的方法是______在蛋白质水平上鉴定的方法是______
（6）大面积种植抗虫棉会对该地区生态平和造成怎样的影响？______．
正确答案
解：（1）基因工程的四个操作步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达．
（2）目的基因的获取方法一般有从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法．
（3）一个基因表达载体的组成有启动子、终止子、目的基因和 标记基因等．
（4）将目的基因导入受体细胞的方法很多，图中利用了农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞中．
（5）目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上．这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是DNA分子杂交技术．若从个体水平可以用抗虫的接种实验来进行检测．
（6）大面积种植抗虫棉，会破坏该地区食物链，影响生物多样性．
故答案为：
（1）基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞
（2）人工合成法
（3）标记基因
（4）农杆菌转化法
（5）DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交
（6）破坏食物链，影响生物多样性
解析
解：（1）基因工程的四个操作步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达．
（2）目的基因的获取方法一般有从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法．
（3）一个基因表达载体的组成有启动子、终止子、目的基因和 标记基因等．
（4）将目的基因导入受体细胞的方法很多，图中利用了农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞中．
（5）目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上．这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是DNA分子杂交技术．若从个体水平可以用抗虫的接种实验来进行检测．
（6）大面积种植抗虫棉，会破坏该地区食物链，影响生物多样性．
故答案为：
（1）基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞
（2）人工合成法
（3）标记基因
（4）农杆菌转化法
（5）DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交
（6）破坏食物链，影响生物多样性
为培育出含β-胡萝卜素的“黄金大米”，科研人员提出以下两套培育方案．请分析回答下列问题：
（1）甲方案中，β-胡萝卜素基因能在玉米和水稻体内出现相同表达结果的原因是______．若研究人员已知β-胡萝卜素基因序列，可采用______方法获得β-胡萝卜素基因．②过程中可用______技术检测水稻体细胞DNA上是否插入了β-胡萝卜素基因．
（2）乙方案中，在体细胞杂交前需要用______酶除去细胞壁获得原生质体，诱导其融合的化学试剂常用______．通过⑤获得“黄金大米”幼苗需要经过______两个过程，依据的原理是______．在培养过程中，除了在培养基中添加营养物质外，还需要添加______．
（3）与传统育种方法相比，甲、乙两套方案共同的优点是______．
正确答案
解：（1）自然界中所有生物共用一套遗传密码子，因此一种生物的基因能在另一种生物体内表达；在目的基因序列已知的情况下，可采用人工合成的方法获得目的基因．检测目的基因是否插入受体细胞可用DNA分子杂交技术．
（2）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因此可根据酶的专一性原理，在植物体细胞杂交前用纤维素酶和果胶酶除去细胞壁获得原生质体；诱导植物原生质体融合常用的化学试剂是聚乙二醇．⑤过程中将杂交细胞培育成杂交植株需要采用植物组织培养激素，该技术包括脱分化和再分化两个过程，原理是植物细胞的全能性；在植物组织培养过程中，除了在培养基中添加营养物质外，还需要添加植物激素（生长素和细胞分裂素）．
（3）与传统育种方法相比，基因工程育种和植物细胞工程育种都能克服远缘杂交不亲和的障碍．
故答案为：
（1）所有生物共用一套遗传密码 人工合成 DNA分子杂交
（2）纤维素酶和果胶 聚乙二醇 脱分化和再分化 （植物）细胞的全能性 （植物）激素（生长素和细胞分裂素）
（3）克服远缘杂交不亲和的障碍（打破生殖隔离）
解析
解：（1）自然界中所有生物共用一套遗传密码子，因此一种生物的基因能在另一种生物体内表达；在目的基因序列已知的情况下，可采用人工合成的方法获得目的基因．检测目的基因是否插入受体细胞可用DNA分子杂交技术．
（2）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因此可根据酶的专一性原理，在植物体细胞杂交前用纤维素酶和果胶酶除去细胞壁获得原生质体；诱导植物原生质体融合常用的化学试剂是聚乙二醇．⑤过程中将杂交细胞培育成杂交植株需要采用植物组织培养激素，该技术包括脱分化和再分化两个过程，原理是植物细胞的全能性；在植物组织培养过程中，除了在培养基中添加营养物质外，还需要添加植物激素（生长素和细胞分裂素）．
（3）与传统育种方法相比，基因工程育种和植物细胞工程育种都能克服远缘杂交不亲和的障碍．
故答案为：
（1）所有生物共用一套遗传密码 人工合成 DNA分子杂交
（2）纤维素酶和果胶 聚乙二醇 脱分化和再分化 （植物）细胞的全能性 （植物）激素（生长素和细胞分裂素）
（3）克服远缘杂交不亲和的障碍（打破生殖隔离）
【生物一选修3：现代生物科技专题】
人体细胞内含有抑制癌症发生的p53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测．
（1）目的基因的获取方法通常包括从______中获取和人工化学合成，为了获得更多的目的基因，可以用______技术使目的基因在生物体外大量扩增．
（2）上图表示从正常人和患者体内获取的p53基因的部分区域．与正常人相比，患者在该区域的碱基会发生改变，这种变异被称为______，是生物变异的______来源．
（3）已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的p53基因部分区域（见图），那么正常人的会被切成______种长度的片段；而患者的则被切割成长度为______对碱基和______对碱基的片段．
（4）如果某人的p53基因区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片段，那么该人的基因型______（以P+表示正常基因，P-异常基因）．
正确答案
解：（1）获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成法．
（2）基因突变是指DNA中碱基对的增添、缺失或替换，所以基因中碱基的改变称为基因突变．基因突变能产生新基因，是生物变异的根本来源．
（3）正常人的p53基因部分区域有两个限制酶E识别位点，切割后会被切成3个片段；患者的p53基因部分区域中从左向右第一个限制酶E识别位点发生突变，不能被切割，故会切成长度为460对碱基和220对碱基的两种片段．
（4）该个体p53基因部分区域出现四种片段，说明该个体含有正常基因和异常基因，即基因型为P+P-．
故答案为：
（1）基因文库（基因组文库或cDNA文库 ） PCR
（2）基因突变 根本
（3）3 460 220
（4）P+P-
解析
解：（1）获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成法．
（2）基因突变是指DNA中碱基对的增添、缺失或替换，所以基因中碱基的改变称为基因突变．基因突变能产生新基因，是生物变异的根本来源．
（3）正常人的p53基因部分区域有两个限制酶E识别位点，切割后会被切成3个片段；患者的p53基因部分区域中从左向右第一个限制酶E识别位点发生突变，不能被切割，故会切成长度为460对碱基和220对碱基的两种片段．
（4）该个体p53基因部分区域出现四种片段，说明该个体含有正常基因和异常基因，即基因型为P+P-．
故答案为：
（1）基因文库（基因组文库或cDNA文库 ） PCR
（2）基因突变 根本
（3）3 460 220
（4）P+P-
普通棉花中含β-甘露糖苷酶基因（GhMnaA2），能在纤维细胞中特异性表达，产生的β-甘露糖苷酶催化半纤维素降解，棉纤维长度变短．为了培育新的棉花品种，科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体，利用农杆菌转化法导入棉花细胞，成功获得转基因棉花品种，具体过程如下．请分析回答：
（1）①和②过程中所用的限制性内切酶分别是______、______．
（2）基因表达载体除了图示组成外，至少还有______、______等．
（3）③过程中用酶切法可鉴定正、反义表达载体．用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得0.05kb、3.25kb、5.95kb、9.45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是______和______．
（4）④过程中利用农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是______，转化后的细胞再通过______形成植物体．
（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达，其意义是______．
正确答案
解：（1）纤维细胞E6启动子前后含有限制酶HindⅢ和BamHⅠ的切割位点，因此可以用这两种酶切割；②是构建反义GhMnaA2基因表达载体的过程，反义GhMnaA2基因前后有限制酶SmaⅠ的切割位点，因此可以该酶切割获取目的基因．
（2）基因表达载体由启动子、目的基因、复制原点、终止子和标记基因等部分组成．
（3）③过程中，用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得0.05kb、3.25kb、5.95kb、9.45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是0.05kb+5.95kb=6.0kb、3.25kb+9.45kb=12.7kb．
（4）农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是含有E6启动子和GhMnaA2基因的T-DNA．转化后，还需依据植物细胞的全能性，采用植物组织培养技术将受体细胞培养形成植物体．
（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达的翻译过程，进而阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长．
故答案为：
（1）HindⅢ、BamHⅠSmaⅠ
（2）复制原点、终止子、标记基因等
（3）6.0kb 12.7kb
（4）（含有E6启动子和GhMnaA2基因的）T-DNA 植物组织培养
（5）阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长
解析
解：（1）纤维细胞E6启动子前后含有限制酶HindⅢ和BamHⅠ的切割位点，因此可以用这两种酶切割；②是构建反义GhMnaA2基因表达载体的过程，反义GhMnaA2基因前后有限制酶SmaⅠ的切割位点，因此可以该酶切割获取目的基因．
（2）基因表达载体由启动子、目的基因、复制原点、终止子和标记基因等部分组成．
（3）③过程中，用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正义基因表达载体获得0.05kb、3.25kb、5.95kb、9.45kb四种长度的DNA片段，则用NotⅠ酶切反义基因表达载体获得DNA片段的长度应是0.05kb+5.95kb=6.0kb、3.25kb+9.45kb=12.7kb．
（4）农杆菌介导转化棉花细胞的过程中，整合到棉花细胞染色体DNA的区段是含有E6启动子和GhMnaA2基因的T-DNA．转化后，还需依据植物细胞的全能性，采用植物组织培养技术将受体细胞培养形成植物体．
（5）导入细胞内的反义GhMnaA2转录的mRNA能与细胞内的GhMnaA2转录的mRNA互补配对，从而抑制基因的表达的翻译过程，进而阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长．
故答案为：
（1）HindⅢ、BamHⅠSmaⅠ
（2）复制原点、终止子、标记基因等
（3）6.0kb 12.7kb
（4）（含有E6启动子和GhMnaA2基因的）T-DNA 植物组织培养
（5）阻止β-甘露糖苷酶合成，使棉纤维更长
P5CS是植物合成脯氨酸的关键酶，脯氨酸有助于植物抵御干旱．如图1是将P5CS基因转入烟草细胞获得耐旱烟草植株过程的示意图．
（1）要将P5CS基因成功插入Ti质粒中，Ti质粒的中应含有______限制酶的酶切割位点．
（2）若用两种识别切割序列完全不同的限制酶M和N切割Ti质粒DNA，通过凝胶电泳分离分析得下表．限制酶M和N的识别序列和切割位点如图2所示．
该Ti质粒DNA的长度为______kb．在该DNA分子中，M酶的切割位点有______个．M酶与N酶切出的能相互粘连的末端能在酶的作用下相互连接，请将连接的结果表示出来：______．连接后的序列是否可以用M酶、N酶进行切割，并简述理由：______．
（3）③过程需在农杆菌的培养基中添加______才能筛选出含P5CS基因的Ti质粒的农杆菌．
（4）转基因是否成功，在个体水平上检测可采用的指标是______．
（5）将转入P5CS基因的烟草细胞培养成完整的植物需要用______技术，愈伤组织通过再分化（细胞增殖和分化）发育成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加______．
（6）下列有关基因工程的叙述错误的是（______）（多选）
A．质粒上的目的基因必须整合到受体细胞的DNA上才能不被分解
B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞
D．质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接．
正确答案
解：（1）由图可知，目的基因前有HindⅢ限制酶切割位点，后有SalⅠ限制酶切割位点，因此要将P5CS基因成功插入Ti质粒中，Ti质粒的T-DNA中应含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位点．
（2）表格中+表示该片段的存在以及含量，用酶M切割产生了一个1.0kb的、一个5.0kb的、一个10.0kb的片段，因此则该DNA的长度为16Kb．由于质粒为环状DNA，用酶M得到3个片段，则有3个切点，用酶N得到2个片段，则有2个切点．M酶和N酶切割能得到相同的黏性末端，可以用DNA连接酶催化连接，连接如图
（3）由图可知，标记基因是四环素抗性基因，因此③过程需在农杆菌的培养基中添加四环素才能筛选出含P5CS基因的Ti质粒的农杆菌．
（4）检测目的基因是否整合到烟草细胞染色体DNA上，采用DNA分子杂交技术；转基因是否成功可以直接在个体水平上对转基因植物与非转基因植物的抗旱（或耐旱）性能进行比较．
（5）将转基因烟草细胞培育成完整的植株还需采用植物组织培养技术，该技术包括脱分化和再分化两个重要的步骤，即转基因烟草细胞首先经过脱分化过程形成愈伤组织，愈伤组织再经过再分化发育成完整植株；决定脱分化和再分化的关键因素是植物激素的种类和比例，尤其是生长素和细胞分裂素．
（6）A、用质粒作为运载体时，质粒上的目的基因不需要整合到受体细胞的DNA上，用病毒或噬菌体作为运载体时，目的基因需整合到受体细胞DNA上，A错误；
B、真核生物基因有编码区和非编码区之分，并且编码区包括外显子和内含子，而以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因只包含外显子，没有内含子和非编码序列，因此与原基因的碱基序列不同，B错误；
C、没有与目的基因重组的普通质粒也可以进入受体细胞，C正确；
D、质粒上至少要有一个标记基因，抗生素抗性基因为标记基因，有利于检测目的基因是否导入受体细胞，D错误．
故选：ABD．
故答案为：
（1）HindⅢ、SalⅠ
（2）16kb； 3
（3）四环素
（4）抗旱/耐旱
（5）植物组织培养 植物激素（生长素和细胞分裂素）
（6）ABD
解析
解：（1）由图可知，目的基因前有HindⅢ限制酶切割位点，后有SalⅠ限制酶切割位点，因此要将P5CS基因成功插入Ti质粒中，Ti质粒的T-DNA中应含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位点．
（2）表格中+表示该片段的存在以及含量，用酶M切割产生了一个1.0kb的、一个5.0kb的、一个10.0kb的片段，因此则该DNA的长度为16Kb．由于质粒为环状DNA，用酶M得到3个片段，则有3个切点，用酶N得到2个片段，则有2个切点．M酶和N酶切割能得到相同的黏性末端，可以用DNA连接酶催化连接，连接如图
（3）由图可知，标记基因是四环素抗性基因，因此③过程需在农杆菌的培养基中添加四环素才能筛选出含P5CS基因的Ti质粒的农杆菌．
（4）检测目的基因是否整合到烟草细胞染色体DNA上，采用DNA分子杂交技术；转基因是否成功可以直接在个体水平上对转基因植物与非转基因植物的抗旱（或耐旱）性能进行比较．
（5）将转基因烟草细胞培育成完整的植株还需采用植物组织培养技术，该技术包括脱分化和再分化两个重要的步骤，即转基因烟草细胞首先经过脱分化过程形成愈伤组织，愈伤组织再经过再分化发育成完整植株；决定脱分化和再分化的关键因素是植物激素的种类和比例，尤其是生长素和细胞分裂素．
（6）A、用质粒作为运载体时，质粒上的目的基因不需要整合到受体细胞的DNA上，用病毒或噬菌体作为运载体时，目的基因需整合到受体细胞DNA上，A错误；
B、真核生物基因有编码区和非编码区之分，并且编码区包括外显子和内含子，而以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因只包含外显子，没有内含子和非编码序列，因此与原基因的碱基序列不同，B错误；
C、没有与目的基因重组的普通质粒也可以进入受体细胞，C正确；
D、质粒上至少要有一个标记基因，抗生素抗性基因为标记基因，有利于检测目的基因是否导入受体细胞，D错误．
故选：ABD．
故答案为：
（1）HindⅢ、SalⅠ
（2）16kb； 3
（3）四环素
（4）抗旱/耐旱
（5）植物组织培养 植物激素（生长素和细胞分裂素）
（6）ABD
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