- 基因工程的基本操作程序
- 共6244题
某研究小组进行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工作，如图为他们前期研究工作的简要操作流程图：
（1）实验步骤①所代表的反应过程是______；在步骤②之前扩增H基因常采用的方法是______．
（2）步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用的酶是______．
（3）构建重组表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用做基因工程载体的是______；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上______的表达．
（4）某志愿者接种甲型H1N1流感疫苗后，第15天感染甲型H1N1流感病毒，则体内______细胞将迅速增殖分化形成______细胞，从而产生大量抗体；当该病毒侵入人体细胞后所引起的免疫反应是______与宿主细胞紧密接触并使其裂解．
（5）抗体的化学本质是______．
正确答案
解：（1）实验步骤①RNA→DNA所代表的反应过程是逆转录；在步骤②之前扩增H基因常采用的方法是PCR技术，原理是DNA复制．
（2）需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割运载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和运载体．故步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用的酶是限制酶和DNNA连接酶．
（3）构建重组表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用做基因工程载体的是质粒；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上标记基因的表达．
（4）某志愿者接种甲型H1N1流感疫苗后，第15天感染甲型H1N1流感病毒，则体内记忆细胞将迅速增殖分化形成效应B（浆）细胞，从而产生大量抗体；当该病毒侵入人体细胞后所引起的免疫反应是效应T细胞与宿主细胞紧密接触并使其裂解．
（5）抗体专门抗击相应抗原的蛋白质．
故答案为：
（1）逆转录 PCR技术
（2）限制酶和DNNA连接酶
（3）质粒 标记基因
（4）记忆 效应B（浆） 效应T细胞
（5）蛋白质
解析
解：（1）实验步骤①RNA→DNA所代表的反应过程是逆转录；在步骤②之前扩增H基因常采用的方法是PCR技术，原理是DNA复制．
（2）需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割运载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和运载体．故步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用的酶是限制酶和DNNA连接酶．
（3）构建重组表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用做基因工程载体的是质粒；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上标记基因的表达．
（4）某志愿者接种甲型H1N1流感疫苗后，第15天感染甲型H1N1流感病毒，则体内记忆细胞将迅速增殖分化形成效应B（浆）细胞，从而产生大量抗体；当该病毒侵入人体细胞后所引起的免疫反应是效应T细胞与宿主细胞紧密接触并使其裂解．
（5）抗体专门抗击相应抗原的蛋白质．
故答案为：
（1）逆转录 PCR技术
（2）限制酶和DNNA连接酶
（3）质粒 标记基因
（4）记忆 效应B（浆） 效应T细胞
（5）蛋白质
为提高我国稻米的含铁量，通过农杆菌介导将菜豆的铁结合蛋白基因导入了一个高产粳稻品种中，获得了高含铁量转基因水稻株系．如图为培育过程．请分析并回答问题：
（1）获取重组载体用到的“手术刀”是______．②过程通常用______法将重组载体导入愈伤组织细胞．
（2）重组载体中的标记基因的作用是______．检测目的基因是否转录，需用______作探针．
（3）图中①③④过程须在______条件下进行，培养基中除加入营养物质外，还需添加植物激素，作用是______．
（4）过程④除了用秋水仙素或低温诱导来处理，还可以采用______技术，该技术常用的诱导剂是______．
正确答案
解：（1）获取重组载体用到的“手术刀”是限制性核酸内切酶．②过程是将目的基因导入受体细胞，由于水稻属于双子叶植物，通常用农杆菌转化法将重组载体导入愈伤组织细胞．
（2）重组载体中的标记基因的作用是检测目的基因是否导入受体细胞．检测目的基因是否转录，需用同位素标记的铁结合蛋白基因作探针，即分子杂交的方法．
（3）图中基因工程的操作以及植物的组织培养过程须在无菌条件下进行，培养基中除加入营养物质外，还需添加植物激素，作用是促进细胞分裂、生长、分化．
（4）由于花药培养出的细胞染色体是体细胞的一般，因此过程④用秋水仙素或低温诱导来处理是为了让细胞的染色体数目加倍，该过程还可以采用植物体细胞杂交技术，该技术常用的诱导剂是聚乙二醇．
故答案为：
（1）限制性核酸内切酶 农杆菌转化
（2）检测目的基因是否导入受体细胞 同位素标记的铁结合蛋白基因
（3）无菌 促进细胞分裂、生长、分化
（4）植物体细胞杂交 聚乙二醇
解析
解：（1）获取重组载体用到的“手术刀”是限制性核酸内切酶．②过程是将目的基因导入受体细胞，由于水稻属于双子叶植物，通常用农杆菌转化法将重组载体导入愈伤组织细胞．
（2）重组载体中的标记基因的作用是检测目的基因是否导入受体细胞．检测目的基因是否转录，需用同位素标记的铁结合蛋白基因作探针，即分子杂交的方法．
（3）图中基因工程的操作以及植物的组织培养过程须在无菌条件下进行，培养基中除加入营养物质外，还需添加植物激素，作用是促进细胞分裂、生长、分化．
（4）由于花药培养出的细胞染色体是体细胞的一般，因此过程④用秋水仙素或低温诱导来处理是为了让细胞的染色体数目加倍，该过程还可以采用植物体细胞杂交技术，该技术常用的诱导剂是聚乙二醇．
故答案为：
（1）限制性核酸内切酶 农杆菌转化
（2）检测目的基因是否导入受体细胞 同位素标记的铁结合蛋白基因
（3）无菌 促进细胞分裂、生长、分化
（4）植物体细胞杂交 聚乙二醇
资料2 巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达．
（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，需要用到______处理．
（2）获取HBsAg基因时，可利用______、方法获取．
（3）构建的重组质粒中有5′AOX1、3′AOX1（TT）和HBsAg基因外，还应有______．
（4）步骤1中的方法是______，此时的大肠杆菌处于______状态．
（5）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞
中是否含有HBsAg基因，可以用______方法进行检测．
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合
成后，细胞可以对其进行______并分泌到细胞外，便于提取．
正确答案
解：（1）获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒．
（2）获取目的基因时，可利用从基因文库获取、人工合成等方法获取．
（3）基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因．
（4）在目的基因导入细菌细胞内时，需要用Ga2+处理，此时的大肠杆菌处于感受态（易吸收外界DNA分子的状态）状态．
（5）转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子杂交方法进行检测．
（6）细菌是原核生物，只含核糖体一种细胞器，而酵母菌是真核生物，除含有核糖体外，还含有内质网、高尔基体等细胞器．所以与细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行加工（修饰）并分泌到细胞外，便于提取．
故答案为：
（1）DNA连接酶
（2）从基因文库获取、人工合成
（3）标记基因
（4）Ga2+处理 感受态（易吸收外界DNA分子的状态）
（5）DNA分子杂交
（6）加工（修饰）
解析
解：（1）获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒．
（2）获取目的基因时，可利用从基因文库获取、人工合成等方法获取．
（3）基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因．
（4）在目的基因导入细菌细胞内时，需要用Ga2+处理，此时的大肠杆菌处于感受态（易吸收外界DNA分子的状态）状态．
（5）转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子杂交方法进行检测．
（6）细菌是原核生物，只含核糖体一种细胞器，而酵母菌是真核生物，除含有核糖体外，还含有内质网、高尔基体等细胞器．所以与细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行加工（修饰）并分泌到细胞外，便于提取．
故答案为：
（1）DNA连接酶
（2）从基因文库获取、人工合成
（3）标记基因
（4）Ga2+处理 感受态（易吸收外界DNA分子的状态）
（5）DNA分子杂交
（6）加工（修饰）
该技术的主要步骤及应用如下：
（1）第一步是构建打靶载体．把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因______
（2）第二步是将打靶载体通过______技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的．
（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞．用含______的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基______所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）．
（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入______体内，使其发育成嵌合体小鼠．嵌合体小鼠与______小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠．
（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究______的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除______．
正确答案
解：（1）第一步是构建打靶载体．把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因失活．
（2）第二步是将打靶载体通过显微注射技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的．
（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞．用含新霉素的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基淘汰所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）．
（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入代孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠．嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠．
（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究目的基因（敲除基因）的功能的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除免疫排斥反应．
故答案为：
（1）失活（灭活）
（2）显微注射
（3）新霉素 淘汰（毒死、杀死、去除）
（4）假孕（代孕、另一只）母鼠 野生型
（5）目的基因（敲除基因）的功能 免疫排斥（排斥反应）
解析
解：（1）第一步是构建打靶载体．把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因失活．
（2）第二步是将打靶载体通过显微注射技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的．
（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞．用含新霉素的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基淘汰所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）．
（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入代孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠．嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠．
（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究目的基因（敲除基因）的功能的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除免疫排斥反应．
故答案为：
（1）失活（灭活）
（2）显微注射
（3）新霉素 淘汰（毒死、杀死、去除）
（4）假孕（代孕、另一只）母鼠 野生型
（5）目的基因（敲除基因）的功能 免疫排斥（排斥反应）
人组织纤溶酶原激活物（htPA）是一种重要的药用蛋白，可在转htPA基因母羊的羊乳中获得．流程如下：
（1）将重组表达载体导入受精卵常用的方法是______．检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用______技术．
（2）为获取更多的卵（母）细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其______．采集的精子需要经过______，才具备受精能力．
（3）图中的卵母细胞应在体外培养到______期．
（4）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到______，说明目的基因成功表达．
正确答案
解：（1）将目的导入动物细胞最有效的方法是显微注射法．检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用DNA分子杂交技术．
（2）对供体母羊注射促性腺激素可促使其超数排卵．采集的精子需要经过获能处理才具备受精能力．
（3）图中的卵母细胞应在体外培养到减数第二次分裂中期才成熟．
（4）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到htPA（或人组织纤溶酶原激活物），说明目的基因成功表达．
故答案为：
（1）显微注射法 DNA分子杂交
（2）超数排卵 获能（处理）
（3）减数第二次分裂中期
（4）htPA（或人组织纤溶酶原激活物）
解析
解：（1）将目的导入动物细胞最有效的方法是显微注射法．检测目的基因是否已插入受体细胞DNA，可采用DNA分子杂交技术．
（2）对供体母羊注射促性腺激素可促使其超数排卵．采集的精子需要经过获能处理才具备受精能力．
（3）图中的卵母细胞应在体外培养到减数第二次分裂中期才成熟．
（4）若在转htPA基因母羊的羊乳中检测到htPA（或人组织纤溶酶原激活物），说明目的基因成功表达．
故答案为：
（1）显微注射法 DNA分子杂交
（2）超数排卵 获能（处理）
（3）减数第二次分裂中期
（4）htPA（或人组织纤溶酶原激活物）
（Ⅰ）．chlL基因是蓝藻（蓝细菌）DNA上控制叶绿素合成的基因，为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞．技术路线如图甲所示，请据图分析回答：
（1）构建重组质粒B在整个操作过程中的目的是______和______．
（2）若含有chlL基因的DNA片段和选用的质粒上的限制酶切割位点如图乙所示．请回答：
①构建含chlL基因的重组质粒A时，应选用的限制酶是______，对______ 进行切割．
②同时用酶1和酶4切割图乙中的质粒，则产生含有1800对碱基和8200对碱基的两种片段；用图中四种酶同时切割此质粒，则产生含有600对碱基和8200对碱基的两种片段；若换用酶1和酶3同时切割此质粒，则产生的片段是______．
（Ⅱ）．科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达．图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程．请据图丙回答问题：
（1）图丙中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过①和②步骤后，有些质粒上的______基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活．
（2）步骤③是______的过程，为了促进该过程，应该用______处理大肠杆菌．
（3）步骤④：将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是______筛选，能在C中生长的大肠杆菌有______种．
（4）步骤⑤：用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D（含氨苄青霉素和四环素）和E（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示，含目的基因的菌落位于______（D、E）上．请在图中相应的位置上圈出含目的基因的菌落．
______．
正确答案
解：Ⅰ（1）②过程是将红霉素抗性基因插入chlL基因，这样可以改变ch1l基因的结构，同时使重组质粒含有标记基因，便于筛选出导入重组质粒B的蓝细菌．
（2）①含有chlL基因的外源DNA分子含有限制酶1、2和3的切割位点，但限制酶2的切割位点位于目的基因上，所以构建含chlL基因的重组质粒A时，应选用的限制酶1和酶3，对质粒和ch1l基因进行切割．
②所以换用酶l和酶3同时切割此质粒，则产生的片段是1200对碱基和8800对碱基．
Ⅱ（1）由图中限制酶切割位置可知，目的基因插入的位置是氨苄青霉素抗性基因中．
（2）步骤③是基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞，为了促进此过程，应该用CaCl2溶液（Ca2+）处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使其变成感受态细胞．
（3）培养基C是选择培养基，培养基中有四环素，专一筛选含四环素抗性基因的大肠杆菌，能在C中生长的大肠杆菌有两种，分别是抗四环素和同时抗四环素和含氨苄青霉素的大肠杆菌．
（4）D培养基中大肠杆菌对四环素和含氨苄青霉素都抗，而E中只抗一种四环素，所以在E中对应区域（D中没有菌落的部位），该处为转基因大肠杆菌．含目的基因的菌落为：
故答案为：
Ⅰ（1）改变ch1l基因的结构 便于筛选出导入重组质粒B的蓝细菌
（4）①酶1和酶3 质粒和ch1l基因 ②1200对碱基和8800对碱基
Ⅱ（1）氨苄青霉素抗性
（2）将重组质粒导入大肠杆菌 CaCl2
（3）含四环素抗性基因的大肠杆菌 2
（4）E
解析
解：Ⅰ（1）②过程是将红霉素抗性基因插入chlL基因，这样可以改变ch1l基因的结构，同时使重组质粒含有标记基因，便于筛选出导入重组质粒B的蓝细菌．
（2）①含有chlL基因的外源DNA分子含有限制酶1、2和3的切割位点，但限制酶2的切割位点位于目的基因上，所以构建含chlL基因的重组质粒A时，应选用的限制酶1和酶3，对质粒和ch1l基因进行切割．
②所以换用酶l和酶3同时切割此质粒，则产生的片段是1200对碱基和8800对碱基．
Ⅱ（1）由图中限制酶切割位置可知，目的基因插入的位置是氨苄青霉素抗性基因中．
（2）步骤③是基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞，为了促进此过程，应该用CaCl2溶液（Ca2+）处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使其变成感受态细胞．
（3）培养基C是选择培养基，培养基中有四环素，专一筛选含四环素抗性基因的大肠杆菌，能在C中生长的大肠杆菌有两种，分别是抗四环素和同时抗四环素和含氨苄青霉素的大肠杆菌．
（4）D培养基中大肠杆菌对四环素和含氨苄青霉素都抗，而E中只抗一种四环素，所以在E中对应区域（D中没有菌落的部位），该处为转基因大肠杆菌．含目的基因的菌落为：
故答案为：
Ⅰ（1）改变ch1l基因的结构 便于筛选出导入重组质粒B的蓝细菌
（4）①酶1和酶3 质粒和ch1l基因 ②1200对碱基和8800对碱基
Ⅱ（1）氨苄青霉素抗性
（2）将重组质粒导入大肠杆菌 CaCl2
（3）含四环素抗性基因的大肠杆菌 2
（4）E
海藻糖是一种天然的糖类，存在于许多植物中．玉米中含有的海藻糖酶能减少这种糖的含量，从而使玉米对干旱和极端高温更为敏感．科学家在玉米基因组中加入了根瘤菌的基因，用来抑制海藻糖酶的活性，从而获得了高海藻糖抗旱玉米植株．
（1）在抗旱玉米的培育过程中目的基因需要用______来提取，培育过程的核心步骤为______．
（2）目的基因导入玉米细胞最常用的方法是______．
（3）目的基因导入受体细胞后，要检测目的基因是否表达，常用的检测方法有______和______．
（4）用导入目的基因的玉米细胞快速繁殖抗旱植株需要用到______技术，该技术的核心是______和______．
正确答案
解：（1）目的基因获取需要用限制酶来提取，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤．
（2）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法．
（3）目的基因导入受体细胞后，检测目的基因是否转录出了mRNA，可以用DNA分子与mRNA分子杂交技术．检测目的基因是否翻译成蛋白质，可以用抗原-抗体杂交技术检测．
（4）用导入目的基因的玉米细胞，可以通过植物组织培养将玉米细胞快速繁殖抗旱植株，该技术包括脱分化和再分化过程．
故答案为：
（1）限制酶 基因表达载体的构建
（2）农杆菌转化法
（3）DA分子与mRNA分子杂交 抗原-抗体杂交
（4）植物组织培养 脱分化 再分化
解析
解：（1）目的基因获取需要用限制酶来提取，基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤．
（2）将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法．
（3）目的基因导入受体细胞后，检测目的基因是否转录出了mRNA，可以用DNA分子与mRNA分子杂交技术．检测目的基因是否翻译成蛋白质，可以用抗原-抗体杂交技术检测．
（4）用导入目的基因的玉米细胞，可以通过植物组织培养将玉米细胞快速繁殖抗旱植株，该技术包括脱分化和再分化过程．
故答案为：
（1）限制酶 基因表达载体的构建
（2）农杆菌转化法
（3）DA分子与mRNA分子杂交 抗原-抗体杂交
（4）植物组织培养 脱分化 再分化
请回答下列有关基因工程的问题．
下表是基因工程中几种限制酶识别序列及其切割位点．图1是转基因香蕉的培育过程，含目的基因的外源DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点．
（1）从转基因香蕉培育图中反映了质粒作为运载体的特点是______，基因工程中还可以用______作为运载体．
（2）图1中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaI酶切割，原因是______
（3）图2是用______（限制）酶进行切割得到的目的基因．可以防止含目的基因的外源DNA片段切割后自身环化．
（4）人体细胞内含有抑制癌症发生的某基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测．该基因含有800对碱基对（bp），用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp，．用EcoRⅠ再次切割得到100bp，300bp，150bp，50bp，200bp．而患者体内获取的这段基因，用BamHⅠ切割得到的区段变为400bp，400bp，用EcoRⅠ再次切割得到100bp，300bp，150bp，250bp．在正常人体内BamHⅠ和EcoRⅠ识别序列分别有______个和______个，患者体内发生了______．
（5）下列有关基因工程的叙述错误的是______（多选）
A．质粒上的目的基因必须整合到受体细胞的DNA上才能不被分解
B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
C．没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞
D．质粒上的抗生素抗性基因有利于质粒与外源基因连接．
正确答案
解：（1）质粒作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来．基因工程中还可以用病毒（噬菌体或动植物病毒）作为运载体．
（2）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（3）根据图1中DNA片段两侧的黏性末端可知，左侧是用限制酶BamHI切割形成的，右侧是用限制酶HindⅢ切割形成的，这样可以防止含目的基因的外源DNA片段切割后自身环化．
（4）该基因用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp三种长度的DNA片段，说明在正常人体内BamHⅠ的识别序列有2个；用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp后，再用EcoRⅠ再次切割得到100bp，300bp，150bp，50bp，200bp，说明400bp被切割成100bp，300bp，其中一个200bp被切割成150bp，50bp，可见EcoRⅠ识别序列也有2个．患者体内获取的这段基因，用BamHⅠ切割得到的区段变为400bp，400bp，用EcoRⅠ再次切割得到100bp，300bp，150bp，250bp，说明有一个BamHⅠ识别序列发生了基因突变，不能被BamHⅠ切割．
（5）A、用质粒作为运载体时，质粒上的目的基因不需要整合到受体细胞的DNA上，用病毒或噬菌体作为运载体时，目的基因需整合到受体细胞DNA上，A错误；
B、真核生物基因有编码区和非编码区之分，并且编码区包括外显子和内含子，而以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因只包含外显子，没有内含子和非编码序列，因此与原基因的碱基序列不同，B错误；
C、没有与目的基因重组的普通质粒也可以进入受体细胞，C正确；
D、质粒上的抗生素抗性基因有利于检测外源基因的导入，D错误．
故选：ABD．
故答案为：
（1）有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存 噬菌体或动植物病毒
（2）SmaI酶会破坏目的基因和质粒
（3）BamHⅠ和HindⅢ
（4）2 2 基因突变
（5）ABD
解析
解：（1）质粒作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来．基因工程中还可以用病毒（噬菌体或动植物病毒）作为运载体．
（2）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（3）根据图1中DNA片段两侧的黏性末端可知，左侧是用限制酶BamHI切割形成的，右侧是用限制酶HindⅢ切割形成的，这样可以防止含目的基因的外源DNA片段切割后自身环化．
（4）该基因用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp三种长度的DNA片段，说明在正常人体内BamHⅠ的识别序列有2个；用BamHⅠ切割得到的400bp，200bp，200bp后，再用EcoRⅠ再次切割得到100bp，300bp，150bp，50bp，200bp，说明400bp被切割成100bp，300bp，其中一个200bp被切割成150bp，50bp，可见EcoRⅠ识别序列也有2个．患者体内获取的这段基因，用BamHⅠ切割得到的区段变为400bp，400bp，用EcoRⅠ再次切割得到100bp，300bp，150bp，250bp，说明有一个BamHⅠ识别序列发生了基因突变，不能被BamHⅠ切割．
（5）A、用质粒作为运载体时，质粒上的目的基因不需要整合到受体细胞的DNA上，用病毒或噬菌体作为运载体时，目的基因需整合到受体细胞DNA上，A错误；
B、真核生物基因有编码区和非编码区之分，并且编码区包括外显子和内含子，而以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因只包含外显子，没有内含子和非编码序列，因此与原基因的碱基序列不同，B错误；
C、没有与目的基因重组的普通质粒也可以进入受体细胞，C正确；
D、质粒上的抗生素抗性基因有利于检测外源基因的导入，D错误．
故选：ABD．
故答案为：
（1）有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存 噬菌体或动植物病毒
（2）SmaI酶会破坏目的基因和质粒
（3）BamHⅠ和HindⅢ
（4）2 2 基因突变
（5）ABD
河北农科院的科学家通过基因工程培育抗虫棉时，需要从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，“放入”棉花的细胞中与棉花的DNA结合起来并发挥作用，请回答下列有关问题：
（1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是______，此工具主要存在于______中，其特点是______．
（2）苏云金芽孢杆菌一个DNA分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是“______”．具体做法是：用限制性核酸内切酶将苏云金芽孢杆菌的DNA切成许多片段，然后将这些片段______，再通过运载体转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把______分离出来．
（3）进行基因工程操作一般要经过的四个步骤依次是______、______、______、______．
正确答案
解：（1）获取目的基因的工具是限制酶，其主要存在于微生物中，特点是能识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切断DNA．
（2）苏云金芽孢杆菌一个DNA分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是“鸟枪法”．具体做法是：用限制性核酸内切酶将苏云金芽孢杆菌的DNA切成许多片段，然后将这些片段分别与运载体结合，再通过运载体转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来．
（3）进行基因工程操作一般要经过的四个步骤依次是：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达．
故答案为：
（1）限制性核酸内切酶 微生物 能识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切断DNA
（2）鸟枪法 分别与运载体结合 带有目的基因的DNA片段
（3）提取目的基因 目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达
解析
解：（1）获取目的基因的工具是限制酶，其主要存在于微生物中，特点是能识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切断DNA．
（2）苏云金芽孢杆菌一个DNA分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是“鸟枪法”．具体做法是：用限制性核酸内切酶将苏云金芽孢杆菌的DNA切成许多片段，然后将这些片段分别与运载体结合，再通过运载体转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来．
（3）进行基因工程操作一般要经过的四个步骤依次是：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达．
故答案为：
（1）限制性核酸内切酶 微生物 能识别特定的脱氧核苷酸序列并在特定位点切断DNA
（2）鸟枪法 分别与运载体结合 带有目的基因的DNA片段
（3）提取目的基因 目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和表达
研究发现，将心肌细胞直接移植到心脏受损部位能够改善心脏功能，是一种治疗缺血性心脏病的有效方法．胚胎干细胞（ESC）在体外能诱导分化为心肌细胞，但同时会产生大量非心肌细胞．科研人员利用基因工程技术，使增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在心肌细胞特异性表达，以利于从ESC分化来的细胞中筛选心肌细胞．该基因工程技术基本流程如图．请回答：
（1）过程①中，利用限制酶Mlu I、Nhe I处理以获得______．
（2）过程②的目的是使______基因在______细胞中特异性表达．
（3）过程③中，从囊胚分离出______，进行培养可获得ESC．
（4）进行过程④时，______（能/不能）在饲养层细胞上进行．
正确答案
解：（1）过程①中，利用限制酶Mlu I、Nhe I处理以获得α-MHC启动子，使得α-MHC基因在心肌细胞中能转录．
（2）过程②表示基因表达载体的构建，目的是使EGFP基因在胚胎干细胞中稳定存在，并在肌细胞中特异性表达．
（3）过程③中，从囊胚分离出内细胞团，具有发育的全能性，属于胚胎干细胞，进行培养可获得ESC．
（4）胚胎干细胞在饲养层细胞上能够维持不分化的状态，过程④表示细胞增殖和分化，则不能在饲养层细胞上进行．
故答案为：
（1）α-MHC启动子
（2）EGFP 心肌
（3）内细胞团
（4）不能
解析
解：（1）过程①中，利用限制酶Mlu I、Nhe I处理以获得α-MHC启动子，使得α-MHC基因在心肌细胞中能转录．
（2）过程②表示基因表达载体的构建，目的是使EGFP基因在胚胎干细胞中稳定存在，并在肌细胞中特异性表达．
（3）过程③中，从囊胚分离出内细胞团，具有发育的全能性，属于胚胎干细胞，进行培养可获得ESC．
（4）胚胎干细胞在饲养层细胞上能够维持不分化的状态，过程④表示细胞增殖和分化，则不能在饲养层细胞上进行．
故答案为：
（1）α-MHC启动子
（2）EGFP 心肌
（3）内细胞团
（4）不能
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