- 基因工程的基本操作程序
- 共6244题
科研人员通过基因工程实现了β-甘露聚糖酶基因在猪肠道野生酵母菌中的表达，使原来不能被猪利用的粗纤维在猪肠道内被分解成可直接吸收的单糖．如图为构建工程菌的部分过程，其中介导序列能引导载体整合到酵母菌的染色体DNA上．请回答：
（1）①过程中需要的工具酶是______，②③过程中需要的工具酶是______．
（2）同尾酶是指切割DNA分子后能产生相同黏性末端的限制酶，图中4种限制酶中属于同尾酶的是______．
（3）重组表达载体中的介导序列引导目的基因整合到酵母菌的染色体DNA上，其意义在于______．
（4）①过程从野生酵母菌染色体DNA中PCR扩增介导序列时，科研人员设计了如下一对引物：GAATTC和CCTAGG，其中下划线部分序列的设计依据是______，方框部分序列的设计目的是______．
（5）对重组表达载体进行酶切鉴定，假设所用的酶均可将识别位点完全切开．若使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，得到______种DNA片断．若使用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，得到______种DNA片断．
正确答案
解：（1）图中①表示采用PCR技术扩增介导序列的过程，该过程在高温条件下进行，需要热稳定性DNA聚合酶；②③表示基因表达载体的构建过程，除了图中的限制酶外，该过程中还需要DNA连接酶．
（2）表中限制酶BamHⅠ和BglⅡ的识别序列不同，但两者切割产生的黏性末端相同，属于同尾酶．
（3）转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键．重组表达载体中的介导序列引导目的基因整合到酵母菌的染色体DNA上，这可使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达．
（4）①过程从野生酵母菌染色体DNA中PCR扩增介导序列时，科研人员设计了如下一对引物：GAATTC和CCTAGG，引物是根据已知核苷酸序列设计的，因此其中下划线部分序列的设计依据是介导序列两端的部分DNA序列；GAATTC是限制酶EcoRⅠ的识别序列，而CCTAGG是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此方框部分序列的设计目的是使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列．
（5）由图可知，重组的基因表达载体含有2个EcoRⅠ酶割位点，含有1个SalⅠ酶切位点，因此使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切重组质粒可以得到3种DNA片断．重组的基因表达载体含有2个EcoRⅠ酶割位点，但不再含有BamHⅠ酶割位点，因此用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重组质粒可以得到2种DNA片断．
故答案为：
（1）热稳定性DNA聚合酶（Taq酶或耐高温的DNA聚合酶） DNA连接酶
（2）BamHⅠ和BglⅡ
（3）使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达
（4）介导序列两端的部分DNA序列 使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列
（5）3 2
解析
解：（1）图中①表示采用PCR技术扩增介导序列的过程，该过程在高温条件下进行，需要热稳定性DNA聚合酶；②③表示基因表达载体的构建过程，除了图中的限制酶外，该过程中还需要DNA连接酶．
（2）表中限制酶BamHⅠ和BglⅡ的识别序列不同，但两者切割产生的黏性末端相同，属于同尾酶．
（3）转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键．重组表达载体中的介导序列引导目的基因整合到酵母菌的染色体DNA上，这可使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达．
（4）①过程从野生酵母菌染色体DNA中PCR扩增介导序列时，科研人员设计了如下一对引物：GAATTC和CCTAGG，引物是根据已知核苷酸序列设计的，因此其中下划线部分序列的设计依据是介导序列两端的部分DNA序列；GAATTC是限制酶EcoRⅠ的识别序列，而CCTAGG是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此方框部分序列的设计目的是使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列．
（5）由图可知，重组的基因表达载体含有2个EcoRⅠ酶割位点，含有1个SalⅠ酶切位点，因此使用EcoRⅠ和SalⅠ酶切重组质粒可以得到3种DNA片断．重组的基因表达载体含有2个EcoRⅠ酶割位点，但不再含有BamHⅠ酶割位点，因此用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重组质粒可以得到2种DNA片断．
故答案为：
（1）热稳定性DNA聚合酶（Taq酶或耐高温的DNA聚合酶） DNA连接酶
（2）BamHⅠ和BglⅡ
（3）使目的基因能随工程菌染色体稳定遗传和表达
（4）介导序列两端的部分DNA序列 使扩增出的介导序列两端含有限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列
（5）3 2
（1）质粒可存在于细菌细胞内，它的化学本质是______，标记基因的作用是______，图中A是______；在基因工程中，需要在______酶的作用下才能完成剪接过程．
（2）在上图基因工程的操作过程中，遵循碱基互补配对原则的步骤有______．（用图中序号表示）．
（3）研究中发现，番茄体内的蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，导致害虫无法消化食物而被杀死，人们成功地将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米体内，玉米获得了与番茄相似的抗虫性状，玉米这种变异的来源是______．
（4）科学家在某种植物中找到了抗枯萎病的基因，并用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经______过程培养成具备了抗病性的植株，这说明______．
正确答案
解：（1）质粒是一种双链环状DNA分子；标记基因的作用是鉴别和筛选；图中A是目的基因，其与运载体（质粒）连接形成重组质粒；基因工程中，“剪切”时需要限制酶，“连接”时需要DNA连接酶．
（2）在上图基因工程的操作过程中，②基因表达载体的构建和④目的基因的扩增过程遵循碱基互补配对原则．
（3）人们成功地将Bt毒蛋白基因导入番茄体内，使番茄获得了与苏云金芽孢杆菌相似的抗虫性状，这种性状是通过基因工程技术实现的，而基因工程的原理是基因重组．
（3）将转基因细胞培育成转基因植株需要采用植物组织培养技术．用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明目的基因（抗枯萎病的基因）已表达．
故答案为：
（1）DNA 鉴别和筛选 载体 限制酶和DNA连接
（2）②④
（3）基因重组
（4）植物组织培养 目的基因（抗枯萎病的基因）已表达
解析
解：（1）质粒是一种双链环状DNA分子；标记基因的作用是鉴别和筛选；图中A是目的基因，其与运载体（质粒）连接形成重组质粒；基因工程中，“剪切”时需要限制酶，“连接”时需要DNA连接酶．
（2）在上图基因工程的操作过程中，②基因表达载体的构建和④目的基因的扩增过程遵循碱基互补配对原则．
（3）人们成功地将Bt毒蛋白基因导入番茄体内，使番茄获得了与苏云金芽孢杆菌相似的抗虫性状，这种性状是通过基因工程技术实现的，而基因工程的原理是基因重组．
（3）将转基因细胞培育成转基因植株需要采用植物组织培养技术．用基因工程的方法将该基因导入金茶花叶片细胞的染色体DNA上，经培养长成的植株具备了抗病性，这说明目的基因（抗枯萎病的基因）已表达．
故答案为：
（1）DNA 鉴别和筛选 载体 限制酶和DNA连接
（2）②④
（3）基因重组
（4）植物组织培养 目的基因（抗枯萎病的基因）已表达
（2015秋•许昌期末）下表中列出了几种限制酶识别序列及其割位点，图一、图二中箭头表示相关限制酶的位点．请回答下列问题：
（1）一个图一所示的质粒分子经Sma I切割前后，分别含有______个游离的磷酸基团．
（2）若对图一中质粒进行改造，插入Sma I 酶切位点越多，质粒的稳定性越______．
（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma I切割，原因是______．
（4）与只是用EcoR I 相比较，使用BamH I和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止______．
（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入______．
（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了______．
正确答案
解：（1）由于质粒在切割前是一个环状DNA分子，因此上面没有游离的磷酸基团；当质粒被切割后形成了两个末端各有1个游离的磷酸基团，故共有2个游离的磷酸基团．
（2）SmaⅠ酶切位点越多，表示G和C这一对碱基对所占的比例就超高，而G和C之间含有三个氢键，故其热稳定性超高．
（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中 均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（4）构建含目的基因的重组质粒A时，选用 BamhHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，同理，也可以防止质粒自身环化．
（5）为了使目的基因和质粒之间的磷酸二脂键相连，需要用DNA连接酶相连接．
（6）抗生素抗性基因是一种抗性基因，抗性基因是为了鉴别和筛选目的基因是否导入到受体细胞内．
故答案为：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
（5）DNA连接酶
（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞
解析
解：（1）由于质粒在切割前是一个环状DNA分子，因此上面没有游离的磷酸基团；当质粒被切割后形成了两个末端各有1个游离的磷酸基团，故共有2个游离的磷酸基团．
（2）SmaⅠ酶切位点越多，表示G和C这一对碱基对所占的比例就超高，而G和C之间含有三个氢键，故其热稳定性超高．
（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中 均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（4）构建含目的基因的重组质粒A时，选用 BamhHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，同理，也可以防止质粒自身环化．
（5）为了使目的基因和质粒之间的磷酸二脂键相连，需要用DNA连接酶相连接．
（6）抗生素抗性基因是一种抗性基因，抗性基因是为了鉴别和筛选目的基因是否导入到受体细胞内．
故答案为：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
（5）DNA连接酶
（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞
2009年10月，我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”获得农业部颁发的安全证书．如图表示该抗虫水稻主要培育流程，据图回答：
（1）④过程应用的主要生物技术是______．
（2）杀虫基因（crylA）是人们根据几种Bt毒蛋白的分子结构，设计并人工合成的，这属于______工程技术范畴．
（3）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造．如图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因及部分限制性内切酶作用位点），据图分析：
①人工改造时，要使抗虫基因表达，还应插入______．
②人工改造时用限制酶II处理，其目的是：第一，去除质粒上的______（基因），保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于______．第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等．
③若用限制酶I分别切割改造过的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒．分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的现象是______．
（4）若限制酶Ⅱ切割DNA分子后形成的粘性末端为
正确答案
解：（1）如图导入目的基因的受体细胞培养成植株需要用到植物组织培养技术．
（2）生产出自然界没有的蛋白质属于蛋白质工程．
（3）①作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子．图中的Ti质粒缺少启动子，所以要使抗虫基因表达，还应插入启动子．
②若用限制酶II处理该质粒，可去除质粒上的tms基因和tmr基因，这样可以保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；用限制酶II处理后，该质粒只保留了一个限制酶作用位点，这样有利于目的基因的准确插入．
③用限制酶I分别切割改造过的理想质粒，破环了Ti质粒上的四环素抗性基因，但没有破环卡那霉素抗性基因，所以分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到现象是在含有卡那霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长．
（4）限制酶识别的核苷酸序列一般是回文序列，所以由黏性末端序列可知该酶识别的核苷酸序列．
故答案为：
（1）植物组织培养
（2）蛋白质
（3）①启动子 ②tms和tmr 目的基因（或外源DNA）准确插入
③在含卡那霉素的培养基能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
（4）GACGTC
解析
解：（1）如图导入目的基因的受体细胞培养成植株需要用到植物组织培养技术．
（2）生产出自然界没有的蛋白质属于蛋白质工程．
（3）①作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子．图中的Ti质粒缺少启动子，所以要使抗虫基因表达，还应插入启动子．
②若用限制酶II处理该质粒，可去除质粒上的tms基因和tmr基因，这样可以保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；用限制酶II处理后，该质粒只保留了一个限制酶作用位点，这样有利于目的基因的准确插入．
③用限制酶I分别切割改造过的理想质粒，破环了Ti质粒上的四环素抗性基因，但没有破环卡那霉素抗性基因，所以分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到现象是在含有卡那霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长．
（4）限制酶识别的核苷酸序列一般是回文序列，所以由黏性末端序列可知该酶识别的核苷酸序列．
故答案为：
（1）植物组织培养
（2）蛋白质
（3）①启动子 ②tms和tmr 目的基因（或外源DNA）准确插入
③在含卡那霉素的培养基能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
（4）GACGTC
请回答下列有关胚胎工程和基因工程方面的问题：
（1）目前，科学家通过细胞核移植实验，培育出多种哺乳动物新类型．在哺乳动物的核移植实验中，一般通过电刺激将受体细胞激活，使其进行细胞分裂并发育，当胚胎发育到______阶段时，将胚胎植入另一雌性（代孕）动物体内．
（2）在“试管牛”的培育过程中，要使精子和卵母细胞在体外成功结合，需要对精子
进行______处理．另外，培养的卵母细胞需要发育至减数分裂第______次分裂，该时期在显微镜下可观察到次级卵母细胞和第一极体．
（3）利用体细胞进行核移植技术的难度明显高于利用胚胎细胞进行核移植的原因是______．
（4）若要使获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、______、终止子、标记基因和复制原点等．目前常用的措施是将该基因表达载体导入牛的______（填“受精卵”或“乳腺细胞”）．
（5）下列关于基因工程的叙说正确的是______．
A．目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶、DNA连接酶及载体是基因工程中常用的工具酶
C．若检测培育的抗虫棉花是否成功，可用相应的病菌侵染棉花植株
D．载体上的抗性基因有利于检测目的基因是否插入到受体细胞的染色体上
（6）关于胚胎工程的正确叙述是______．
A．通过胚胎干细胞核移植可得到一群性状完全相同的个体
B．将人的精子与卵细胞在体外受精，再将受精卵植入女性子宫内发育成“试管婴儿”
C．胚胎发育在桑椹胚阶段，胚胎内部出现大的空腔
D．在胚胎干细胞培养过程中，加入的饲养层细胞分泌一些物质既能抑制细胞分化又能促进细胞生长．
正确答案
解：（1）在哺乳动物的核移植实验中，一般通过电脉冲（或电刺激）将受体细胞激活，使其进行细胞分裂并发育；当胚胎发育到桑葚胚或囊胚阶段时，将胚胎植入另一雌性（代孕）动物体内．
（2）体外受精时，需要对精子进行获能处理．另外，培养的卵母细胞需要发育至MⅡ中期（减数分裂第二次分裂中期）．
（3）由于体细胞分化程度高，不容易恢复全能性，因此利用体细胞进行核移植技术的难度明显高于利用胚胎细胞进行核移植．
（4）基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、人干扰素基因（或目的基因）、终止子、标记基因和复制原点等．培育转基因动物时，常以受精卵为受体细胞．
（5）A、基因工程的目的基因可以来源于动物、植物和微生物，受体细胞也可以是动物、植物和微生物，A正确；
B、基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体，其中限制酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶，B错误；
C、检测培育的抗虫棉花是否成功，可用棉铃虫取食棉花植株，C错误；
D、载体上的抗性基因有利于检测目的基因是否导入重组细胞，但不能检测目的基因是否插入到受体细胞的染色体上，D错误．
故选：A．
（6）A、通过胚胎干细胞核移植可得到一群主要性状相同的个体，另外受到细胞质的影响，A错误；
B、将人的精子与卵细胞在体外受精，再将受精卵发育到早期胚胎后再植入女性子宫内发育成“试管婴儿”，B错误；
C、胚胎发育在囊胚阶段，胚胎内部出现大的空腔为囊胚腔，C错误；
D、在胚胎干细胞培养过程中，加入的饲养层细胞分泌一些物质既能抑制细胞分化又能促进细胞生长，D正确．
故选：D
故答案为；
（1）桑葚胚或囊胚
（2）获能 二
（3）体细胞分化程度高，不容易恢复全能性
（4）人干扰素基因（或目的基因） 受精卵
（5）A
（6）D
解析
解：（1）在哺乳动物的核移植实验中，一般通过电脉冲（或电刺激）将受体细胞激活，使其进行细胞分裂并发育；当胚胎发育到桑葚胚或囊胚阶段时，将胚胎植入另一雌性（代孕）动物体内．
（2）体外受精时，需要对精子进行获能处理．另外，培养的卵母细胞需要发育至MⅡ中期（减数分裂第二次分裂中期）．
（3）由于体细胞分化程度高，不容易恢复全能性，因此利用体细胞进行核移植技术的难度明显高于利用胚胎细胞进行核移植．
（4）基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、人干扰素基因（或目的基因）、终止子、标记基因和复制原点等．培育转基因动物时，常以受精卵为受体细胞．
（5）A、基因工程的目的基因可以来源于动物、植物和微生物，受体细胞也可以是动物、植物和微生物，A正确；
B、基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体，其中限制酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶，B错误；
C、检测培育的抗虫棉花是否成功，可用棉铃虫取食棉花植株，C错误；
D、载体上的抗性基因有利于检测目的基因是否导入重组细胞，但不能检测目的基因是否插入到受体细胞的染色体上，D错误．
故选：A．
（6）A、通过胚胎干细胞核移植可得到一群主要性状相同的个体，另外受到细胞质的影响，A错误；
B、将人的精子与卵细胞在体外受精，再将受精卵发育到早期胚胎后再植入女性子宫内发育成“试管婴儿”，B错误；
C、胚胎发育在囊胚阶段，胚胎内部出现大的空腔为囊胚腔，C错误；
D、在胚胎干细胞培养过程中，加入的饲养层细胞分泌一些物质既能抑制细胞分化又能促进细胞生长，D正确．
故选：D
故答案为；
（1）桑葚胚或囊胚
（2）获能 二
（3）体细胞分化程度高，不容易恢复全能性
（4）人干扰素基因（或目的基因） 受精卵
（5）A
（6）D
（1）组装噬菌体时，可被噬菌体蛋白质包装的DNA长度约为36～51kb，则经人工改造的λgtl0载体可插入的外源DNA的最大长度为kb．人工改造载体时，为获得较大的插入能力，可删除λ噬菌体DNA组成中的______序列以缩短其长度______．
（2）λ噬菌体DNA上通常没有适合的标记基因，因此人工改造时需加装适合的标记基因，如图λgtl0载体中的imm434基因．该基因编码一种阻止λ噬菌体进入溶菌状态的阻遏物．构建基囚克隆载体需用到的酶是______，外源DNA的插入位置应位于imm434基因______（之中/之外），使经侵染培养后的受体菌处于______状态．
（3）蛋白质与DNA相比，特有的化学元素是______，若用放射性同位素标记该元素，再用被标记的噬菌体侵染未被标记的细菌，短时保温后搅拌、离心，可检测到放射性物质主要分布在试管______部分．
正确答案
解：（1）由于组装噬菌体时，可被噬菌体蛋白质包装的DNA最大长度是51kb，经人工改造λgtl0载体的长度为43.4kb，那么插入的外源DNA的最大长度是7.6kb．由于λ噬菌体DNA中分为三段，左臂是含有编码蛋白质外壳的序列，中臂是控制溶原生长的序列，而右臂是含重要调控序列，所以人工改造载体时，可删除的是中臂．
（2）基因工程中需要用到限制酶和DNA连接酶来切割和拼接DNA片段．由于采用的标记基因，即imm434基因，能编码一种阻止λ噬菌体进入溶菌状态的阻遏物，所以外源DNA应该插入该基因之中，这样就使得经侵染培养后的受体菌处于溶菌状态．
（3）蛋白质与DNA相比，特有的化学元素是S元素，采用放射性同位素标记方法，用被标记的噬菌体侵染未被标记的细菌，短时保温后搅拌、离心，可检测到放射性物质主要分布在试管的上清液中，因为噬菌体中含有S的蛋白质外壳是不进入细菌体内的．
故答案为：
（1）7.6 控制溶原生长（或中部）
（2）限制酶和DNA连接酶 之中 溶菌
（3）S 上清夜
解析
解：（1）由于组装噬菌体时，可被噬菌体蛋白质包装的DNA最大长度是51kb，经人工改造λgtl0载体的长度为43.4kb，那么插入的外源DNA的最大长度是7.6kb．由于λ噬菌体DNA中分为三段，左臂是含有编码蛋白质外壳的序列，中臂是控制溶原生长的序列，而右臂是含重要调控序列，所以人工改造载体时，可删除的是中臂．
（2）基因工程中需要用到限制酶和DNA连接酶来切割和拼接DNA片段．由于采用的标记基因，即imm434基因，能编码一种阻止λ噬菌体进入溶菌状态的阻遏物，所以外源DNA应该插入该基因之中，这样就使得经侵染培养后的受体菌处于溶菌状态．
（3）蛋白质与DNA相比，特有的化学元素是S元素，采用放射性同位素标记方法，用被标记的噬菌体侵染未被标记的细菌，短时保温后搅拌、离心，可检测到放射性物质主要分布在试管的上清液中，因为噬菌体中含有S的蛋白质外壳是不进入细菌体内的．
故答案为：
（1）7.6 控制溶原生长（或中部）
（2）限制酶和DNA连接酶 之中 溶菌
（3）S 上清夜
科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以再相对寒冷的环境中生长．质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制酶切割位点．图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（ampr为抗氨苄青霉素基因），其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞．请据图作答：
（1）在构建重组质粒时，为了避免目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，此实例应该选用限制酶______对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．
（2）图中③④过程中，需要向培养基中加入起调节作用的物质是______．
（3）愈伤组织常用做诱变育种的理想材料，理由是______．
（4）经组织培养筛选获得的番茄叶绿素突变体，其叶绿素a与叶绿素b的比值显著大于对照组，叶绿素总量不变．某同学用______（填序号：①绿色；②红色；③蓝紫色；④黄色）光照射突变体和对照组叶片，检测到两者光合作用放氧速率差异不大．
正确答案
解：（1）含目的基因的外源DNA分子上有PstⅠ、SmaⅠ、AluⅠ三种限制酶切割位点，但用AluⅠ切割会破坏目的基因，单独用PstⅠ切割会导致目的基因或质粒自身环化，也会导致目的基因和载体的黏性末端发生任意连接，因此为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．
（2）图中③是脱分化过程，④是再分化过程，这两个过程都需要向培养基中加入生长素和细胞分裂素．
（3）愈伤组织是一群具有分裂能力的细胞，DNA在细胞分裂时结构最不稳定，最容易发生基因突变，因此愈伤组织常用做诱变育种的理想材料．
（4）叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，对黄色光吸收较少，对绿色光吸收最少，因此用绿色和黄色光照射突变体和对照组叶片，检测到两者光合作用放氧速率差异不大．
故答案为：
（1）PstⅠ、SmaⅠ
（2）生长素和细胞分裂素（或植物激素）
（3）愈伤组织是一群具有分裂能力的细胞，DNA在细胞分裂时结构最不稳定，最容易发生基因突变
（4）①④
解析
解：（1）含目的基因的外源DNA分子上有PstⅠ、SmaⅠ、AluⅠ三种限制酶切割位点，但用AluⅠ切割会破坏目的基因，单独用PstⅠ切割会导致目的基因或质粒自身环化，也会导致目的基因和载体的黏性末端发生任意连接，因此为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实例中，应该选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．
（2）图中③是脱分化过程，④是再分化过程，这两个过程都需要向培养基中加入生长素和细胞分裂素．
（3）愈伤组织是一群具有分裂能力的细胞，DNA在细胞分裂时结构最不稳定，最容易发生基因突变，因此愈伤组织常用做诱变育种的理想材料．
（4）叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，对黄色光吸收较少，对绿色光吸收最少，因此用绿色和黄色光照射突变体和对照组叶片，检测到两者光合作用放氧速率差异不大．
故答案为：
（1）PstⅠ、SmaⅠ
（2）生长素和细胞分裂素（或植物激素）
（3）愈伤组织是一群具有分裂能力的细胞，DNA在细胞分裂时结构最不稳定，最容易发生基因突变
（4）①④
临床上治疗大面积创伤时，可将经特殊处理的猪皮移植到患者的创面处，并在猪皮上开若干个小口植入患者的自体皮，待其生长并最终替换猪皮．研究表明，导入人P基因的转基因猪所提供的“皮肤”可在移植后存活更长时间，能够保证自体皮充分生长．下图为获得这种转基因猪的操作流程，请回答：
（1）过程①中，常用______酶处理，获得的成纤维细胞在体外培养时需一些适宜的条件，包括______环境、营养、适宜的温度和pH、______等条件．
（2）过程②常用的方法是______，检测P基因是否已整合到了成纤维细胞的染色体上，可采用______技术．
（3）过程③采用的是______技术；过程⑤为______技术．
（4）细胞B最终能发育成转基因猪，体现了______．
（5）应用图中③技术可得到人的早期胚胎，并从中分离出______，用于医学研究和治疗，这种方法称为治疗性克隆．我国对此类研究所持的态度是______．
正确答案
解：（1）将动物组织细胞分散成单个细胞常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶；动物细胞培养时需要无菌、无毒的环境、营养、适宜的温度和pH以及一定的气体环境（95%的空气和5%的二氧化碳）等．
（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上可采用DNA分子杂交技术．
（3）过程③需采用动物体细胞核移植技术；过程⑤需采用胚胎移植技术．
（4）通过体细胞核移植技术所得的重组细胞最终能发育成转基因猪，体现了动物体细胞的细胞核具有全能性．
（5）从早期胚胎中获得人体的胚胎干细胞可用于治疗性克隆；我国政府对克隆的态度：禁止生殖性克隆人，坚持四不原则（不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验），但不反对治疗性克隆人．
故答案为：
（1）胰蛋白（或胶原蛋白） 无菌、无毒 气体环境
（2）显微注射法 DNA分子杂交
（3）动物体细胞核移植 胚胎移植
（4）动物体细胞的细胞核具有全能性
（5）胚胎干细胞 不反对
解析
解：（1）将动物组织细胞分散成单个细胞常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶；动物细胞培养时需要无菌、无毒的环境、营养、适宜的温度和pH以及一定的气体环境（95%的空气和5%的二氧化碳）等．
（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上可采用DNA分子杂交技术．
（3）过程③需采用动物体细胞核移植技术；过程⑤需采用胚胎移植技术．
（4）通过体细胞核移植技术所得的重组细胞最终能发育成转基因猪，体现了动物体细胞的细胞核具有全能性．
（5）从早期胚胎中获得人体的胚胎干细胞可用于治疗性克隆；我国政府对克隆的态度：禁止生殖性克隆人，坚持四不原则（不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验），但不反对治疗性克隆人．
故答案为：
（1）胰蛋白（或胶原蛋白） 无菌、无毒 气体环境
（2）显微注射法 DNA分子杂交
（3）动物体细胞核移植 胚胎移植
（4）动物体细胞的细胞核具有全能性
（5）胚胎干细胞 不反对
人的血清蛋白在临床上需求量很大，通常从人的血液中提取．由于艾滋病等血液传染病对人类的威胁与日俱增，使人们对血液制品的使用顾虑重重，基因工程和克隆技术的广泛应用，使利用动物乳汁生产血清蛋白已成为可能．请根据如图回答：
（1）一般情况下，奶牛所产生的能用于体外受精的卵母细胞往往数量不足，我们通常对供体母牛用______处理．
（2）在基因工程中，我们称②为______，在②进入③之前要用______等工具来构建基因表达载体，能实现②进入③的常用方法是______．
（3）图中①一般经______处理可以得到③，从③到④过程中一般利用未受精的卵细胞去核后作为受体，而不用普通的体细胞，原因是______．
（4）⑥是⑤发育的后代，那么⑥的遗传性状和______相似．如果②的数量太少，常用______法扩增，要实现大批量生产血清白蛋白，③提供者的性别应是______．
正确答案
解：（1）一般情况下，对供体母牛用促性腺激素处理，让其超数排卵，以防体外受精时卵母细胞不足．．
（2）本题的目的是让奶牛乳汁生产血清蛋白，在基因工程中，②血清白蛋白基因就是目的基因．目的基因紫进入受体细胞前，要用限制酶和DNA连接酶、载体等工具来构建基因表达载体．当受体细胞时动物细胞时，常用显微注射法将目的基因导入受体细胞中．
（3）胰蛋白酶处理动物组织将其分散成单个细胞．由于卵细胞中含有的细胞质成分更能够促进细胞核的分化，因此一般利用未受精的卵细胞去核后作为受体，而不用普通的体细胞．
（4）⑥是⑤发育的后代，细胞核来自荷斯坦奶牛细胞，那么⑥的遗传性状和荷斯坦奶牛相似．如果目的基因的数量太少，常用PCR技术法扩增，要实现大批量生产血清白蛋白．本题的目的是让奶牛乳汁生产血清蛋白，所以③得性染色体应该为XX，即提供者的性别应是雌性．
故答案为：
（1）促性腺激素
（2）目的基因 限制酶和DNA连接酶、载体 显微注射法
（3）胰蛋白酶 卵细胞中含有的细胞质成分更能够促进细胞核的分化
（4）荷斯坦奶牛 PCR技术 雌性
解析
解：（1）一般情况下，对供体母牛用促性腺激素处理，让其超数排卵，以防体外受精时卵母细胞不足．．
（2）本题的目的是让奶牛乳汁生产血清蛋白，在基因工程中，②血清白蛋白基因就是目的基因．目的基因紫进入受体细胞前，要用限制酶和DNA连接酶、载体等工具来构建基因表达载体．当受体细胞时动物细胞时，常用显微注射法将目的基因导入受体细胞中．
（3）胰蛋白酶处理动物组织将其分散成单个细胞．由于卵细胞中含有的细胞质成分更能够促进细胞核的分化，因此一般利用未受精的卵细胞去核后作为受体，而不用普通的体细胞．
（4）⑥是⑤发育的后代，细胞核来自荷斯坦奶牛细胞，那么⑥的遗传性状和荷斯坦奶牛相似．如果目的基因的数量太少，常用PCR技术法扩增，要实现大批量生产血清白蛋白．本题的目的是让奶牛乳汁生产血清蛋白，所以③得性染色体应该为XX，即提供者的性别应是雌性．
故答案为：
（1）促性腺激素
（2）目的基因 限制酶和DNA连接酶、载体 显微注射法
（3）胰蛋白酶 卵细胞中含有的细胞质成分更能够促进细胞核的分化
（4）荷斯坦奶牛 PCR技术 雌性
“滔滔”是我国第一例转入人体白蛋白基因的转基因试管牛，人们利用该转基因奶牛的乳汁生产人类血清白蛋白．
（1）试管动物实际上是体外受精与胚胎移植两项技术的综合运用．体外受精前需要对奶牛的精子进行______处理．防止多精入卵的生理反应包括______和______．胚胎工程的终端环节是胚胎移植，移植后的胚胎能在受体子宫内存活的生理基础是不发生______．
（2）人体白蛋白基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物所有基因的文库称为______，获得人体白蛋白基因后可以利用______技术进行扩增．人体白蛋白基因一般利用______技术导入牛的受精卵中，当受精卵分裂到囊胚期时，需要取囊胚的______细胞进行性别鉴定，以确保发育成熟的牛能分泌乳汁．
正确答案
解：（1）体外受精前需要对奶牛的精子进行获能处理．防止多精入卵的两道屏障是透明带反应和卵黄膜封闭作用．移植后的胚胎能在受体子宫内存活的生理基础是不发生免疫排斥．
（2）基因文库包括基因组文库和部分基因文库，其中基因组文库含有一种生物所有基因；PCR技术可在体外大量扩增目的基因；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；因为只有雌性奶牛才产生乳汁，因此当受精卵分裂到囊胚期时，需要取囊胚的滋养层细胞进行性别鉴定，以确保发育成熟的牛能分泌乳汁．
故答案为：
（1）获能、透明带反应、卵细胞膜反应、免疫排斥
（2）基因组文库 PCR、显微注射、滋养层
解析
解：（1）体外受精前需要对奶牛的精子进行获能处理．防止多精入卵的两道屏障是透明带反应和卵黄膜封闭作用．移植后的胚胎能在受体子宫内存活的生理基础是不发生免疫排斥．
（2）基因文库包括基因组文库和部分基因文库，其中基因组文库含有一种生物所有基因；PCR技术可在体外大量扩增目的基因；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；因为只有雌性奶牛才产生乳汁，因此当受精卵分裂到囊胚期时，需要取囊胚的滋养层细胞进行性别鉴定，以确保发育成熟的牛能分泌乳汁．
故答案为：
（1）获能、透明带反应、卵细胞膜反应、免疫排斥
（2）基因组文库 PCR、显微注射、滋养层
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