- DNA重组技术的基本工具
- 共1894题
常见的酿酒酵母能利用葡萄糖，不能利用木糖发酵．若用转基因技术将发酵木糖的关键基因--木糖还原酶（XYL1）或木糖异构酶基因（XYLA）转入酿酒酵母中，均能培育出能利用木糖发酵产生酒精的酿酒酵母．图表示XYL1基因与细菌pYMILP质粒重组的过程示意图．图中AMPr是氨苄青霉素抗性基因，其基因产物可使“碘-淀粉”复合物脱色，从而在含有“碘-淀粉”的固体平板上形成透明圈．转化成功的酿酒酵母中含AMPr基因的重组质粒拷贝数越多，透明圈越大．
（1）据图1可知，目的基因的长度是______bp；图中获取目的基因和切割质粒所用的限制性核酸内切酶分别是______、______，最终能形成重组质粒的原因是______．
（2）图2是四个成功导入重组质粒的酵母菌的菌株（品系），在“碘-淀粉”的固体平板上的生长情况，其中目的基因表达量最高的是______，根据题意，分析原因是______此“碘-淀粉”培养基从功能上看属于______培养基．
（3）图3是不同温度条件下重组酿酒酵母菌株的木糖异构酶活性．据图推测，此酶最初来自于______
A．嗜热细菌 B．大肠杆菌 C．葡萄球菌 D．乳酸杆菌．
正确答案
解：（1）分析图1可以看出，质粒的长度是9117bp，重组质粒的长度是10090bp，所以目的基因的长度是10090-9117=973bp；获取目的基因和切割质粒所用的限制性核酸内切酶分别是BamHI和BglⅡ，用限制性内切酶切割以后，可以形成相同的粘性末端，具有相同粘性末端的目的基因和质粒可以形成重组质粒．
（2）转化成功的酿酒酵母中含AMPr基因的重组质粒拷贝数越多，透明圈越大，所以2号目的基因的表达量最高．“碘-淀粉”培养基从功能上看属于选择培养基．
（3）由图3可以看出，木糖异构酶活性的最适温度大于80℃，温度较高，说明该酶最初来自嗜热细菌．
故答案为：
（1）973bp BamHI，BglⅡ，两种酶切后具有相同的粘性末端
（2）2，透明圈越大说明含AMPr 基因的重组质粒拷贝数越多，目的基因数量就越多，表达量越高 选择
（3）A
解析
解：（1）分析图1可以看出，质粒的长度是9117bp，重组质粒的长度是10090bp，所以目的基因的长度是10090-9117=973bp；获取目的基因和切割质粒所用的限制性核酸内切酶分别是BamHI和BglⅡ，用限制性内切酶切割以后，可以形成相同的粘性末端，具有相同粘性末端的目的基因和质粒可以形成重组质粒．
（2）转化成功的酿酒酵母中含AMPr基因的重组质粒拷贝数越多，透明圈越大，所以2号目的基因的表达量最高．“碘-淀粉”培养基从功能上看属于选择培养基．
（3）由图3可以看出，木糖异构酶活性的最适温度大于80℃，温度较高，说明该酶最初来自嗜热细菌．
故答案为：
（1）973bp BamHI，BglⅡ，两种酶切后具有相同的粘性末端
（2）2，透明圈越大说明含AMPr 基因的重组质粒拷贝数越多，目的基因数量就越多，表达量越高 选择
（3）A
回答下列关于基因工程的问题．
草甘膦是一种广谱除草剂，其除草机制是抑制植物体内EPSPS酶的合成，最终导致植物死亡．但是，它的使用有时也会影响到植物的正常生长．目前，已发现可以从一种抗草甘膦的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，若将该基因转入植物细胞内，从而获得的转基因植物就能耐受高浓度的草甘膦．
下图A-F表示6株植物，其中，植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，但是否成功还未知．图1和2分别表示两段DNA序列．表格中1-4分别表示4种限制性核酸内切酶的酶切位点．据图回答下列问题：
（1）若A-C浇清水，D-F浇的水中含有草甘膦，上述植物中，肯定能健康成长的是______．
（2）若要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株甲，在大肠杆菌培养基中还必须加入______．
（3）假设位于EPSPS基因两侧的DNA序列均如图I所示，则应选择表中酶______进行酶切；若位于EPSPS基因两侧的DNA序列分别如图I和II所示，则应选择表中酶______ 进行酶切．
（4）假设大肠杆菌突变菌株甲中EPSPS基因的右侧序列如图II所示，请在方框内画出经酶切后产生的两个末端的碱基序列．
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，但植物F仍没有表现出抗性，分析可能的原因______．
下图甲是某目的基因（4.0kb，1kb=1000对碱基）与大肠杆菌pUC18质粒（2.7kb）重组的示意图．图中Ap′是抗氨苄青霉素基因，lacZ是显色基因，其上的EcoRI识别位点位于目的基因插入位点的右侧，其控制合成的物质能使菌落呈现蓝色．（图乙中深色圆点即为蓝色菌落）
（6）图乙的培养基中含有氨苄青霉素，请判断图乙中所出现的白色和蓝色两种菌落中，何种会含有重组质粒．______．
（7）现用EcoRI酶切质粒，酶切后进行电泳观察，若出现长度为______kb和______kb的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功．（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRI的识别位点之间的碱基对忽略不计）
正确答案
解：（1）根据题意分析可知：植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，所以A-C浇清水，都能健康成长．F虽经过了转基因处理，但是否成功还未知，所以D-F浇的水中含有草甘膦，D肯定不能健康成长，E肯定能健康成长，F未知．因此肯定能健康成长的是ABCE．
（2）要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株，则必须要用含草甘膦的选择培养基培养大肠杆菌．
（3）因为限制酶具有特异性识别的能力，对照图1所示，所以应选择表中酶2进行酶切．对照图1和2所示，则应选择表中酶2和3同时进行酶切．
（4）画图要求：画出完整的DNA片段，要有两个黏性末端，化学键、碱基序列完整且正确．
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，说明F中已含有EPSPS基因，如果仍没有表现出抗性，则说明EPSPS基因在受体细胞中没有表达或表达的酶没有活性．
（6）白色，因为EcoRI将lacZ显色基因破坏了．
（7）目的基因被酶切后形成两个片段：1.0kb和3.0kb；质粒被酶切后长度不变：2.7kb．故质粒只能和目的基因片段之一发生重组，如果成功的话将会出现两种情况：3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb．
故答案为：
（1）ABCE （2）草甘膦 （3）2 2和3
（4）
（5）目的基因在受体细胞中没有表达，或表达的酶没有活性
（6）白色
（7）3.0和3.7或1.0和5.7
解析
解：（1）根据题意分析可知：植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，所以A-C浇清水，都能健康成长．F虽经过了转基因处理，但是否成功还未知，所以D-F浇的水中含有草甘膦，D肯定不能健康成长，E肯定能健康成长，F未知．因此肯定能健康成长的是ABCE．
（2）要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株，则必须要用含草甘膦的选择培养基培养大肠杆菌．
（3）因为限制酶具有特异性识别的能力，对照图1所示，所以应选择表中酶2进行酶切．对照图1和2所示，则应选择表中酶2和3同时进行酶切．
（4）画图要求：画出完整的DNA片段，要有两个黏性末端，化学键、碱基序列完整且正确．
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，说明F中已含有EPSPS基因，如果仍没有表现出抗性，则说明EPSPS基因在受体细胞中没有表达或表达的酶没有活性．
（6）白色，因为EcoRI将lacZ显色基因破坏了．
（7）目的基因被酶切后形成两个片段：1.0kb和3.0kb；质粒被酶切后长度不变：2.7kb．故质粒只能和目的基因片段之一发生重组，如果成功的话将会出现两种情况：3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb．
故答案为：
（1）ABCE （2）草甘膦 （3）2 2和3
（4）
（5）目的基因在受体细胞中没有表达，或表达的酶没有活性
（6）白色
（7）3.0和3.7或1.0和5.7
【选修3-现代生物科技专题】
如图表示“华恢1号”抗虫水稻主要培育流程，据图回答：
（1）crylA基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做______；
（2）杀虫基因（crylA）是根据几种Bt毒蛋白的分子结构，设计并人工合成的，这属于______工程技术范畴．
（3）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造．下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因及部分限制酶作用位点），据图分析：
①改造质粒时，要使抗虫基因能成功表达，还应插入______．
②改造质粒时用限制酶Ⅰ处理，其目的是：第一，去除质粒上的______（基因），保证T-DNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于______．第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等．
③若用限制酶Ⅱ分别切割经过②过程改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒，再分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是______．
（4）一个图所示的质粒分子在限制酶Ⅱ切割的前后，分别含有______个和______个游离的磷酸基团．
（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入______酶．
正确答案
解：（1）转化是指目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种心的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程．
（3）①启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质．
②限制酶Ⅰ的作用位点在tms 基因上，破坏了tms 基因的作用．另外只有一个作用位点，也有利于目的基因（或外源DNA）准确插入．
③限制酶Ⅱ分别切割质粒，破坏了tmr和tet基因，tet基因是四环素抗性基因．但卡那霉素抗性基因没有被破坏．重组Ti质粒，再分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．
（4）质粒为小型环状的DNA分子，环状DNA分子中没有游离的磷酸基团，经过限制酶Ⅱ切割后在切口处每端各含有1个游离的磷酸基团．限制酶Ⅱ切割图所示的质粒分子产生2个切口．
（5）含有目的基因的片段与质粒连接形成重组质粒，需要DNA连接酶将两个DNA片段的末端的“缝隙”连接起来．
故答案为：
（1）植物组织培养
（2）蛋白质
（3）①启动子 ②tms 目的基因（或外源DNA）准确插入 ③在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
（4）0、4
（5）DNA连接酶
解析
解：（1）转化是指目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种心的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程．
（3）①启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质．
②限制酶Ⅰ的作用位点在tms 基因上，破坏了tms 基因的作用．另外只有一个作用位点，也有利于目的基因（或外源DNA）准确插入．
③限制酶Ⅱ分别切割质粒，破坏了tmr和tet基因，tet基因是四环素抗性基因．但卡那霉素抗性基因没有被破坏．重组Ti质粒，再分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．
（4）质粒为小型环状的DNA分子，环状DNA分子中没有游离的磷酸基团，经过限制酶Ⅱ切割后在切口处每端各含有1个游离的磷酸基团．限制酶Ⅱ切割图所示的质粒分子产生2个切口．
（5）含有目的基因的片段与质粒连接形成重组质粒，需要DNA连接酶将两个DNA片段的末端的“缝隙”连接起来．
故答案为：
（1）植物组织培养
（2）蛋白质
（3）①启动子 ②tms 目的基因（或外源DNA）准确插入 ③在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
（4）0、4
（5）DNA连接酶
如图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程．请据图回答下列有关问题：
（1）若限制酶l的识别序列和切点是
（2）将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有______的培养基，能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入，该培养基从功能方面属于选择培养基．
（3）重组质粒导人大肠杆菌的目的是______．
（4）经筛选分析该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子．理论上该转基因植株自交产生的F1代中，优具有抗虫特性且能稳定遗传的植株占总数的______．
（5）⑤过程所用技术称为_______，从遗传学角度来看，根本原因是根细胞具有______．
正确答案
解：（1）质粒中两个标记基因中均有限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，若用该酶切，抗性基因均被破坏，因此用限制酶Ⅱ切割质粒；目的基因可以用限制酶Ⅰ或两种酶一起切割，由于两种切割形成的末端序列相同，因此可以连接．
（2）用限制酶Ⅱ切割质粒，破坏了质粒中的氨苄青霉素抗性基因，因此标记基因是四环素抗性基因，所以应有含四环素的选择培养基上．
（3）由于大肠杆菌的繁殖快，周期短，因此将重组质粒导入大肠杆菌可以扩增目的基因．
（4）由于转基因植株可以看成杂合子（Aa），因此Aa×Aa，后代具有抗虫特性且能稳定遗传的植株（AA）占
（5）根据细胞的全能型（含有发育成完整个体的全部遗传物质），将以分化的根细胞培养成一棵植株，运用了植物组织培养技术．
故答案为：
（1）ⅡⅠ（Ⅰ和Ⅱ）
（2）四环素
（3）大量复制目的基因 （抗虫基因）
（4）1/4
（5）植物组织培养 发育成完整个体的全部遗传物质
解析
解：（1）质粒中两个标记基因中均有限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，若用该酶切，抗性基因均被破坏，因此用限制酶Ⅱ切割质粒；目的基因可以用限制酶Ⅰ或两种酶一起切割，由于两种切割形成的末端序列相同，因此可以连接．
（2）用限制酶Ⅱ切割质粒，破坏了质粒中的氨苄青霉素抗性基因，因此标记基因是四环素抗性基因，所以应有含四环素的选择培养基上．
（3）由于大肠杆菌的繁殖快，周期短，因此将重组质粒导入大肠杆菌可以扩增目的基因．
（4）由于转基因植株可以看成杂合子（Aa），因此Aa×Aa，后代具有抗虫特性且能稳定遗传的植株（AA）占
（5）根据细胞的全能型（含有发育成完整个体的全部遗传物质），将以分化的根细胞培养成一棵植株，运用了植物组织培养技术．
故答案为：
（1）ⅡⅠ（Ⅰ和Ⅱ）
（2）四环素
（3）大量复制目的基因 （抗虫基因）
（4）1/4
（5）植物组织培养 发育成完整个体的全部遗传物质
苏云金杆菌是一种对昆虫有毒害作用的细菌，其杀虫活性物质主要是一类伴孢晶 体蛋白．伴孢晶体蛋白经昆虫肠液消化成毒性肽，并因此导致昆虫死亡．自从培育转基因 植物抗虫棉成功后，研究人员又试图将抗虫基因导入水稻细胞中，从而培养出转基因抗虫 水稻．研究人员从相关生物体内提取出的部分物质或结构如下图所示：图1表示含有目的 基因（抗虫基因）的DWA片段长度（bp为碱基对）和部分碱基序列，图2表示作为运载体的 一种质粒的结构和部分碱基序列．现有Msp I，BamH I，Mbo ISma I 4种限制性核酸内切 酶，它们所识别的碱基序列和酶切位点（用“↓”表示）分别为C↓CGG．G↓ GATCCn↓； GATC、CCC↓ GGG．请回答下列问题：
（1）若用限制酶Sma I完全切割图1中所示DNA片段，则其产物有______种，长度分别为______．
（2）若将图2中质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______．
（3 ）在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的水稻细胞，需配置相应培养基，其中添加的碳源是______，目的是提供营养和______．另外，培养基中除了含有必要营养物质、琼脂和激素外，一般还需要添加______（抗生素A/抗生素B），该培养基从用途上看属于______培养基．
（4）在培养过程中，除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，成功的另一个关键是操作过程必须保证无菌，镊子等器械及培养基都可使用的灭菌方法是______．
正确答案
解：（1）SmaⅠ识别的序列为GGGCCC，切割会产生平末端；图1中DNA片段含有两个SmaⅠ识别位点，第一个识别位点在左端534bp序列向右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658bp序列向左三个碱基的位置，从而两个位点切割后产生的DNA片段的长度分布为534+3，796-3-3，658+3，即得到的DNA片段长度为537、790、661．
（2）能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamHI和识别序列为GATC的MboI，若使用MboI会同时破坏质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamHI来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞．
（3 ）植物组织培养的培养基中添加的碳源是蔗糖，目的为提供营养和调节渗透压．培养基中一般还需要添加抗生素B，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞，从用途上看属于选择培养基．
（4）镊子等器械及培养基都可使用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌．
故答案为：
（1）3，537bp、790bp、661bp
（2）BamH I
（3）蔗糖，调节渗透压． 抗生素B，选择
（4）高压蒸汽灭菌
解析
解：（1）SmaⅠ识别的序列为GGGCCC，切割会产生平末端；图1中DNA片段含有两个SmaⅠ识别位点，第一个识别位点在左端534bp序列向右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658bp序列向左三个碱基的位置，从而两个位点切割后产生的DNA片段的长度分布为534+3，796-3-3，658+3，即得到的DNA片段长度为537、790、661．
（2）能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamHI和识别序列为GATC的MboI，若使用MboI会同时破坏质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamHI来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞．
（3 ）植物组织培养的培养基中添加的碳源是蔗糖，目的为提供营养和调节渗透压．培养基中一般还需要添加抗生素B，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞，从用途上看属于选择培养基．
（4）镊子等器械及培养基都可使用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌．
故答案为：
（1）3，537bp、790bp、661bp
（2）BamH I
（3）蔗糖，调节渗透压． 抗生素B，选择
（4）高压蒸汽灭菌
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