- DNA重组技术的基本工具
- 共1894题
科学家在研究中发现，土壤中的农杆菌具有使植物患“肿瘤”的特性．农杆菌Ti质粒上的T-DNA能转移到植物细胞内，并整合到受体细胞的染色体DNA上表达，正是T-DNA上的三组基因（tms、tmr、tmt）的影响，使植物受伤部位细胞大量分裂与生长，产生“瘤”状结构．科学家受此启发，尝试将Ti质粒作为基因工程中的载体以将目的基因导入受体细胞．下图是通过双质粒导入法研发一种转基因抗虫烟草的过程，请据图分析回答：
（1）Ti质粒上的T-DNA中tms、tmr、tmt三组基因的功能是能控制植物合成______ 等植物激素，使植物患“肿瘤”．
（2）双子叶植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物吸引农杆菌移向这些细胞．此外，酚类化合物能激活Vir基因，合成能专切下T-DNA的限制酶．Vir基因表达的产物可以将质粒上的______ （填“A”或“B”）段切下并整合到植物细胞中．一般情况下，农杆菌不能将T-DNA转移到单子叶植物中，如想采取措施让农杆菌转化单子叶植物，比较简便的办法是______．
（3）进一步研究发现，天然的Ti质粒往往因分子太大而使整合失败，为此，需要对天然Ti质粒进行改造，尽最大可能减小重组质粒的大小．图中的重组质粒并不含有Vir基因，那么，烟草细胞的转化能否成功？请简要说明理由______．
（4）图乙是已经改造后的Ti质粒．根据图中制作重组质粒的过程判断，科学家所选的限制酶是______．
（5）目前，农杆菌转化法和其他转化方法仍然有多个技术缺点不能克服，如目的基因整合到宿主细胞染色体上的位置是随机的，这对宿主细胞造成的危害可能有______．
正确答案
解：（1）细胞大量分裂与生长与细胞分裂素和生长素是有关的．Ti质粒上的T-DNA中tms、tmr、tmt三组基因，使植物受伤部位细胞大量分裂与生长，说明能控制植物合成生长素、细胞分裂素，使植物患“肿瘤”．
（2）Vir基因被双子叶植物伤口部位细胞分泌的酚类化合物所激活，并能合成专切下T-DNA的限制酶．因此，Vir基因表达的产物可以将质粒上T-DNA，即图中的B．农杆菌在受到酚类化合物刺激后，才可以将T-DNA整合到受体细胞的染色体上．要想让农杆菌转化单子叶植物，只需要在单子叶植物的伤口处加入酚类化合物即可．
（3）图中的重组质粒并不含有Vir基因，但是在农杆菌体内含有另一个被改良的质粒含有Vir基因，依然可以表达出只切T-DNA的限制酶．因此烟草细胞的转化依然能够成功．
（4）改造后的Ti质粒时，外源基因加入到T-DNA中间，HindIII切割位点在T-DNA中间．EcoRI的切割位点在T-DNA中间和外侧，有两个切割位点，所以不可取．只需要HindIII 切割Ti质粒，插入外源基因．
（5）农杆菌转化法和其他转化方法仍然有多个技术缺点不能克服，如农杆菌转化法中目的基因整合到宿主细胞染色体上的位置是随机的，这会造成将宿主细胞相应的基因结构破坏或者引起突变．
故答案为：
（1）生长素、细胞分裂素
（2）B 在单子叶植物的伤口处加入酚类化合物
（3）另一个质粒含有Vir基因，仍能表达出产物切下T-DNA
（4）HindIII
（5）可能会引发插入部位基因突变、可能会是插入部位基因失效等
解析
解：（1）细胞大量分裂与生长与细胞分裂素和生长素是有关的．Ti质粒上的T-DNA中tms、tmr、tmt三组基因，使植物受伤部位细胞大量分裂与生长，说明能控制植物合成生长素、细胞分裂素，使植物患“肿瘤”．
（2）Vir基因被双子叶植物伤口部位细胞分泌的酚类化合物所激活，并能合成专切下T-DNA的限制酶．因此，Vir基因表达的产物可以将质粒上T-DNA，即图中的B．农杆菌在受到酚类化合物刺激后，才可以将T-DNA整合到受体细胞的染色体上．要想让农杆菌转化单子叶植物，只需要在单子叶植物的伤口处加入酚类化合物即可．
（3）图中的重组质粒并不含有Vir基因，但是在农杆菌体内含有另一个被改良的质粒含有Vir基因，依然可以表达出只切T-DNA的限制酶．因此烟草细胞的转化依然能够成功．
（4）改造后的Ti质粒时，外源基因加入到T-DNA中间，HindIII切割位点在T-DNA中间．EcoRI的切割位点在T-DNA中间和外侧，有两个切割位点，所以不可取．只需要HindIII 切割Ti质粒，插入外源基因．
（5）农杆菌转化法和其他转化方法仍然有多个技术缺点不能克服，如农杆菌转化法中目的基因整合到宿主细胞染色体上的位置是随机的，这会造成将宿主细胞相应的基因结构破坏或者引起突变．
故答案为：
（1）生长素、细胞分裂素
（2）B 在单子叶植物的伤口处加入酚类化合物
（3）另一个质粒含有Vir基因，仍能表达出产物切下T-DNA
（4）HindIII
（5）可能会引发插入部位基因突变、可能会是插入部位基因失效等
番茄营养丰富，是人们喜爱的一种果蔬．但普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细胞产生多聚半乳醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使蕃茄软化，不耐贮藏．为满足人们的生产生活需要，科学家们通过基因工程技术，培育出了抗软化、保鲜时间长的番茄新品种．操作流程如图并请回答问题：
（1）新品种番茄培育过程中的目的基因是______，受体细胞是______．过程①需要的工具酶有限制性核酸内切酶、______．
（2）可以利用______来筛选含有重组DNA的土壤农杆菌．
（3）在番茄新品种的培育过程中，将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入普通番茄细胞的方法叫做______．培养②③时需要在培养基中加入______来诱导细胞发生______，从而培育出转基因番茄．
（4）从图中可见，mRNA1和mRNA2的结合直接阻碍了遗传信息的______过程，导致了______无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状．多聚半乳糖醛酸酶基因与抗多聚半乳糖醛酸酶基因______（是/不是）等位基因．
（5）除了要对转基因番茄进行分子检测外，有时还需要进行______水平的鉴定．
正确答案
解：（1）根据题意和图形看出，新品种番茄培育过程中的目的基因是：抗多聚半乳糖醛酸酶基因．从图中可以看出，受体细胞是：土壤农杆菌和普通番茄细胞．过程①表示构建基因表达载体．该过程需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割运载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和运载体．
（2）标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，因此筛选出含重组DNA的土壤农杆菌时通常依据重组质粒（重组DNA）上标记基因的表达．
（3）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法．②和③过程是植物组织培养，在培养基中加入植物激素来诱导细胞发生脱分化和再分化，从而培育出转基因番茄．
（4）根据图形看出，mRNA1和mRNA2的结合直接阻碍了遗传信息的翻译过程，导致了多聚半乳糖醛酸酶无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状．多聚半乳糖醛酸酶基因与抗多聚半乳糖醛酸酶基因不是等位基因．
（5）除了要对转基因番茄进行分子检测外，有时还需要进行个体水平的鉴定，可以直接观察转基因番茄是不是具有抗软化、保鲜时间长的优点．
故答案为：
（1）抗多聚半乳糖醛酸酶基因 土壤农杆菌和普通番茄细胞 DNA连接酶
（2）重组质粒（重组DNA）上标记基因的表达
（3）农杆菌转化法 植物激素 脱分化和再分化
（4）翻译 多聚半乳糖醛酸酶 不是
（5）个体
解析
解：（1）根据题意和图形看出，新品种番茄培育过程中的目的基因是：抗多聚半乳糖醛酸酶基因．从图中可以看出，受体细胞是：土壤农杆菌和普通番茄细胞．过程①表示构建基因表达载体．该过程需要限制酶来切割以获取目的基因，同时需要相同的限制酶切割运载体以获取与目的基因相同的黏性末端，再通过DNA连接酶连接目的基因和运载体．
（2）标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，因此筛选出含重组DNA的土壤农杆菌时通常依据重组质粒（重组DNA）上标记基因的表达．
（3）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法．②和③过程是植物组织培养，在培养基中加入植物激素来诱导细胞发生脱分化和再分化，从而培育出转基因番茄．
（4）根据图形看出，mRNA1和mRNA2的结合直接阻碍了遗传信息的翻译过程，导致了多聚半乳糖醛酸酶无法合成，最终使番茄获得了抗软化的性状．多聚半乳糖醛酸酶基因与抗多聚半乳糖醛酸酶基因不是等位基因．
（5）除了要对转基因番茄进行分子检测外，有时还需要进行个体水平的鉴定，可以直接观察转基因番茄是不是具有抗软化、保鲜时间长的优点．
故答案为：
（1）抗多聚半乳糖醛酸酶基因 土壤农杆菌和普通番茄细胞 DNA连接酶
（2）重组质粒（重组DNA）上标记基因的表达
（3）农杆菌转化法 植物激素 脱分化和再分化
（4）翻译 多聚半乳糖醛酸酶 不是
（5）个体
人类在预防与治疗传染病过程中，经常使用疫苗和抗体．已知某传染性疾病的病原体为某种病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，且疫苗生产和抗体制备的流程如图所示．
据图回答下列问题：
（1）过程①构建A基因表达载体时，必须使用______和______两种工具酶．
（2）过程②采用的实验技术是______，获得的X是______．
（3）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的______所制备的疫苗．对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行______比较；或用图中的______进行特异性结合检测．
正确答案
解：（1）①表示基因表达载体的构建过程，需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶连接目的基因和质粒形成重组质粒．
（2）②表示诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合的过程，该过程获得的X是杂交瘤细胞．
（3）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的A蛋白所制备的疫苗．对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行核酸（基因）序列比较；或用图中的抗A蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测．
故答案：（1）限制性核酸内切酶（限制酶、限制性内切酶） DNA连接酶（两空可以互换）
（2）细胞融合 杂交瘤细胞
（3）A蛋白 核酸（基因）序列 抗A蛋白的单克隆抗体
解析
解：（1）①表示基因表达载体的构建过程，需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶连接目的基因和质粒形成重组质粒．
（2）②表示诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合的过程，该过程获得的X是杂交瘤细胞．
（3）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的A蛋白所制备的疫苗．对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行核酸（基因）序列比较；或用图中的抗A蛋白的单克隆抗体进行特异性结合检测．
故答案：（1）限制性核酸内切酶（限制酶、限制性内切酶） DNA连接酶（两空可以互换）
（2）细胞融合 杂交瘤细胞
（3）A蛋白 核酸（基因）序列 抗A蛋白的单克隆抗体
回答下列有关微生物和生物工程的问题．
基因克隆是对分离出来的目的基因进行大量扩增的过程．经过基因克隆，可以生产出大量的目的基因或在基因表达时获得大量的蛋白质．细菌质粒是基因克隆的合适载体，经研究发现，某些细菌质粒中含有两个抗生素抗性基因--氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，而且，在四环素抗性基因中存在限制酶的单一识别序列．
如图表示利用质粒进行基因克隆的过程，其中A-D表示物质，I和II表示抗性基因，①-⑦表示过程，其它数字表示菌落，据图回答下列问题．
（1）写出下列字母和编号的名称：A：______； D：______；II：______；
（2）将A和B形成D所需的酶是______．过程⑤表示______．
（3）为筛选含有物质A的细菌，需进行细菌培养，先在培养基（一）中只加入氨苄青霉素，一段时间后，培养基上长出的细菌菌落具有______特性．然后，用灭菌绒布从培养基（一）中蘸取菌种，再按到只含四环素的培养基（二）中培养．根据培养基（一）和（二）上的细菌生长情况，可以判断图中菌落______（填数字）即为筛选出的含有物质A的细菌，原因是______．
（4）上述培养基从功能上属于______培养基．配制培养基时，在各成分都溶化后分装前，要进行的依次是______和______，培养基配制后采用高压蒸汽灭菌的原因是______．
正确答案
解：（1）由以上分析可知：A是目的基因；D表示重组质粒；由于在四环素抗性基因中存在限制酶的单一识别序列，所以I表示四环素抗性基因，II表示氨苄青霉素抗性基因．
（2）A和B→D表示基因表达载体构建过程，该过程首先需要限制酶处理含有目的基因的外源DNA分子和质粒，形成黏性末端，其次需要DNA连接酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒，因此需的酶有限制酶和DNA连接酶．⑤表示将目的基因导入受体细胞的过程，为了使目的基因导入大肠杆菌，常用CaCl2处理大肠杆菌．
（3）能够在氨苄青霉素的培养基中生长的细菌菌落能够抗氨苄青霉素．在构建基因表达载体时，氨苄青霉素抗性基因未被破坏，所以含有物质A的细菌能在含有氨苄青霉素的培养基上生长；但四环素抗性基因被限制酶破坏了，所以含有物质A的细菌不能在四环素的培养基上生长，由此可见，图中菌落3和5即为筛选出的含有物质A的细菌．
（4）从功能上来说，上述培养基属于选择培养基．配制培养基的过程为：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板．在各成分都溶化后分装前，要进行定容和调pH值．培养基配制后采用高压蒸汽灭菌以杀灭细菌芽孢．
故答案：（1）目的基因 重组质粒 氨苄青霉素抗性基因
（2）限制酶和DNA连接酶 将重组质粒导入受体细胞
（3）抗氨苄青霉素 3、5 由于目的基因破坏了四环素抗性基因，使受体细胞不能在含有四环素的培养基上生长，所以该菌落就是筛选的含有目的基因的菌落
（4）选择 定容 调pH值 杀灭细菌芽孢
解析
解：（1）由以上分析可知：A是目的基因；D表示重组质粒；由于在四环素抗性基因中存在限制酶的单一识别序列，所以I表示四环素抗性基因，II表示氨苄青霉素抗性基因．
（2）A和B→D表示基因表达载体构建过程，该过程首先需要限制酶处理含有目的基因的外源DNA分子和质粒，形成黏性末端，其次需要DNA连接酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒，因此需的酶有限制酶和DNA连接酶．⑤表示将目的基因导入受体细胞的过程，为了使目的基因导入大肠杆菌，常用CaCl2处理大肠杆菌．
（3）能够在氨苄青霉素的培养基中生长的细菌菌落能够抗氨苄青霉素．在构建基因表达载体时，氨苄青霉素抗性基因未被破坏，所以含有物质A的细菌能在含有氨苄青霉素的培养基上生长；但四环素抗性基因被限制酶破坏了，所以含有物质A的细菌不能在四环素的培养基上生长，由此可见，图中菌落3和5即为筛选出的含有物质A的细菌．
（4）从功能上来说，上述培养基属于选择培养基．配制培养基的过程为：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板．在各成分都溶化后分装前，要进行定容和调pH值．培养基配制后采用高压蒸汽灭菌以杀灭细菌芽孢．
故答案：（1）目的基因 重组质粒 氨苄青霉素抗性基因
（2）限制酶和DNA连接酶 将重组质粒导入受体细胞
（3）抗氨苄青霉素 3、5 由于目的基因破坏了四环素抗性基因，使受体细胞不能在含有四环素的培养基上生长，所以该菌落就是筛选的含有目的基因的菌落
（4）选择 定容 调pH值 杀灭细菌芽孢
（七）回答下列有关基因工程和酶工程的有关问题
如图所示为利用现代生物技术获得能表达某蛋白酶工程菌的过程．选用质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点．请回答：
（1）构建含目的基因的重组质粒A时，应选用限制酶______，对______进行切割．再用______进行重组．
（2）图中质粒同时用PstⅠ和ApaⅠ酶切，产生1800对碱基和8200对碱基的两种片段，如用以上四种酶同时切割此质粒，则产生600对碱基和8200对的碱基两种片段，那么用同时用PstⅠ和EcoRⅠ酶切，则产生的片段有______．
（3）筛选后所得到的工程菌增值后表达出大量此蛋白酶，但此蛋白酶不会分泌到细胞外，因此还需要利用酶工程中的______技术获得此蛋白酶，
（4）获得此蛋白酶后，利用酶的固定化技术能回收和重复利用此蛋白酶，以下属于固定化技术中的载体结合法的是______
正确答案
（1）目的基因上PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ切割位点，质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ切割位点．切割质粒和含目的基因的DNA需要同种限制酶．但是目的基因上也有SmaⅠ切割位点，所以选用PstI、EcoRI 切割质粒和含目的基因的DNA．构建表达载体需要DNA连接酶． 故答案为：PstI、EcoRI 质粒和含目的基因的DNA DNA连接酶
（2）质粒同时用PstⅠ和ApaⅠ酶切，产生1800对碱基和8200对碱基的两种片段，说明质粒上含有10000个碱基对．用以上四种酶同时切割此质粒，则产生600对碱基和8200对的碱基两种片段，则说明PstⅠ和SmaⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ切割位点间的都含有600对碱基．那么用同时用PstⅠ和EcoRⅠ酶切，则产生的片段有600+600=1200对碱基（PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ之间的碱基）和600+8200=8800对碱基（EcoRⅠ、ApaⅠ和PstⅠ之间的碱基）． 故答案为1200对碱基、8800对碱基（3）工程菌增值后表达出大量此蛋白酶，但此蛋白酶不会分泌到细胞外，要想获得此蛋白酶，可以利用血红蛋白的提取和鉴定方法进行破碎细胞并分离提纯获得． 故答案为：分离提纯（4）酶本身还是溶于水的，用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中．化学法包括结合法、交联法．吸附法和共价键法又可统称为载体结合法．A、B是包埋法，C是吸附法，D是交联法．故选C
解析
（1）目的基因上PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ切割位点，质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ切割位点．切割质粒和含目的基因的DNA需要同种限制酶．但是目的基因上也有SmaⅠ切割位点，所以选用PstI、EcoRI 切割质粒和含目的基因的DNA．构建表达载体需要DNA连接酶． 故答案为：PstI、EcoRI 质粒和含目的基因的DNA DNA连接酶
（2）质粒同时用PstⅠ和ApaⅠ酶切，产生1800对碱基和8200对碱基的两种片段，说明质粒上含有10000个碱基对．用以上四种酶同时切割此质粒，则产生600对碱基和8200对的碱基两种片段，则说明PstⅠ和SmaⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ、EcoRⅠ和ApaⅠ切割位点间的都含有600对碱基．那么用同时用PstⅠ和EcoRⅠ酶切，则产生的片段有600+600=1200对碱基（PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ之间的碱基）和600+8200=8800对碱基（EcoRⅠ、ApaⅠ和PstⅠ之间的碱基）． 故答案为1200对碱基、8800对碱基（3）工程菌增值后表达出大量此蛋白酶，但此蛋白酶不会分泌到细胞外，要想获得此蛋白酶，可以利用血红蛋白的提取和鉴定方法进行破碎细胞并分离提纯获得． 故答案为：分离提纯（4）酶本身还是溶于水的，用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中．化学法包括结合法、交联法．吸附法和共价键法又可统称为载体结合法．A、B是包埋法，C是吸附法，D是交联法．故选C
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