- DNA重组技术的基本工具
- 共1894题
【生物--现代生物科技专题】
降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等疾病．人的降钙素活性很低，半衰期较短．某科学机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条各72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA，过程如图．
在此过程中发现，合成较长的核苷酸单链易产生缺失碱基的现象．分析回答下列问题：
（1）Klenow酶是一种______酶，获取新型降钙素目的基因的方法是______．
（2）获得的双链DNA经EcoR I（识别序列和切割位点．-G↓LAATTC-）和BamH I（识别序列和切割位点．-G↓GATCC-）双酶切后插入到大肠杆菌质粒中，筛选含重组质粒的大肠杆菌并进行DNA测序验证．
①大肠杆菌是理想的受体细胞，这是因为它______．若选择动物乳房反应器生产新型降钙素，则应将重组DNA导入______细胞，成功后利用胚胎工程，先进行早期胚胎培养，最后通过______，即可获得转基因动物．
②设计EcoR I和B锄 I双酶切的目的是______．
③要进行重组质粒的鉴定和选择，需要大肠杆菌质粒中含有______．
（3）制备该新型降钙素，运用的是现代生物工程技术中的______工程．
正确答案
解：（1）由图可知Klenow酶能够将单链DNA延伸，可见它是一种DNA聚合酶；从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条各72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA．这是运用人工合成法获取目的基因．
（2）①因为大肠杆菌繁殖速度快，多为单细胞，遗传物质相对较少，所以其是基因工程理想的受体细胞；因为受精卵全能性高，所以动物细胞常用受精卵作为受体细胞；接着通过早期胚胎培养和胚胎移植，就可获得转基因动物．
②由于EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列和切点不同，所以用EcoRⅠ和BamHⅠ同时切割，目的基因两侧形成的黏性末端不同，载体也是，这样可以保证目的基因和载体定向连接．
③基因工程中，重组质粒的鉴定和选择依靠标记基因．
（3）根据材料中“从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，获得双链DNA”，可以确定运用的现代生物工程技术是蛋白质工程．
故答案：（1）DNA聚合 人工合成
（2）①繁殖速度快，单细胞，遗传物质相对较少 受精卵 胚胎移植
②保证目的基因和载体定向连接
③标记基因
（3）蛋白
解析
解：（1）由图可知Klenow酶能够将单链DNA延伸，可见它是一种DNA聚合酶；从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条各72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA．这是运用人工合成法获取目的基因．
（2）①因为大肠杆菌繁殖速度快，多为单细胞，遗传物质相对较少，所以其是基因工程理想的受体细胞；因为受精卵全能性高，所以动物细胞常用受精卵作为受体细胞；接着通过早期胚胎培养和胚胎移植，就可获得转基因动物．
②由于EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列和切点不同，所以用EcoRⅠ和BamHⅠ同时切割，目的基因两侧形成的黏性末端不同，载体也是，这样可以保证目的基因和载体定向连接．
③基因工程中，重组质粒的鉴定和选择依靠标记基因．
（3）根据材料中“从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，获得双链DNA”，可以确定运用的现代生物工程技术是蛋白质工程．
故答案：（1）DNA聚合 人工合成
（2）①繁殖速度快，单细胞，遗传物质相对较少 受精卵 胚胎移植
②保证目的基因和载体定向连接
③标记基因
（3）蛋白
肺细胞中的let一7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌．研究人员利用基因工程技术将let一7基因导入肺癌细胞实现表达增强后，发现肺癌细胞的增殖受到抑制．该基因工程技术基本流程如图1．
（1）进行过程①时，需用______酶切开载体以插入let一7基因．进行过程②时，需用______酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于细胞培养．采用PCR技术扩增let一7基因时，在PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水，4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、耐高温的DNA聚合酶和引物l和引物Ⅱ等，若在该反应体系中，目的基因扩增了5代，则具有引物I的DNA所占的比例理论上为______．
（2）研究发现，let一7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2．据图分析，可从细胞中提取______进行分子杂交，以直接检测1et一7基因是否转录．肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中______（RASmRNA/RAS蛋白质）含量减少引起的．
（3）现有一长度为1000碱基对（bp）的DNA分子，用限制酶切开后得到仍是长度为1000bp的DNA分子，说明此DNA分子的形态为______．
（4）某线性DNA分子分别用限制酶HindⅢ和Sma I处理，然后用这两种酶同时处理，得到如下片段（kb为千个碱基对）：
可以推知限制酶HindⅢ和Sma I在此DNA分子中分别有______个识别序列．两酶同时处理后得到的片段，再用限制酶EcoR I处理，结果导致凝胶上3.0kb的片段消失，产生一种1.5kb的新片段；那么如果用限制酶HindⅢ和EcoR I将该线性DNA分子进行切割，则可得到长度分别为______的片段．
正确答案
解：（1）基因工程中用到的基因剪刀是限制性核酸内切酶．要将组织细胞分散开需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理．目的基因扩增了5代，共得到32个DNA分子，除了含有模板DNA链的1个DNA分子外，其余的DNA分子都含有引物I，因此占31/32．
（2）由图2可以看出let一7基因是通过影响转录来影响癌基因RAS表达的，因此从细胞中提取RNA进行分子杂交，以直接检测1et一7基因是否转录．影响转录后RAS蛋白质不能合成，含量会减少．
（3）一长度为1000碱基对（bp）的DNA分子，用限制酶切开后得到仍是长度为1000bp的一个DNA分子，说明该DNA分子是环状的．
（4）由表格信息可知分别用限制酶HindⅢ和Sma I处理后得到的都只有2个片段，说明这个DNA分子中都只有1个它们的酶切位点．限制酶EcoR I处理，凝胶上3.0 kb的片段消失，产生一种1.5 kb的新片段，说明在这段DNA正中间含有一个EcoR I酶酶切位点，综合表格信息可知该DNA片段共有7.7kb，在2.5kb处有HindⅢ酶切位点，在5.5kb处有Sma I酶切位点，在4.0kb处有EcoR I酶切位点，因此用限制酶HindⅢ和EcoR I将该线性DNA分子进行切割，可得到2.5 kb、1.5 kb、3.5 kb的片段．
故答案：
（1）限制性核酸内切酶 胰蛋白 31/32
（2）RNA RAS蛋白质
（3）环状
（4）1、1 2.5 kb、1.5 kb、3.5 kb
解析
解：（1）基因工程中用到的基因剪刀是限制性核酸内切酶．要将组织细胞分散开需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理．目的基因扩增了5代，共得到32个DNA分子，除了含有模板DNA链的1个DNA分子外，其余的DNA分子都含有引物I，因此占31/32．
（2）由图2可以看出let一7基因是通过影响转录来影响癌基因RAS表达的，因此从细胞中提取RNA进行分子杂交，以直接检测1et一7基因是否转录．影响转录后RAS蛋白质不能合成，含量会减少．
（3）一长度为1000碱基对（bp）的DNA分子，用限制酶切开后得到仍是长度为1000bp的一个DNA分子，说明该DNA分子是环状的．
（4）由表格信息可知分别用限制酶HindⅢ和Sma I处理后得到的都只有2个片段，说明这个DNA分子中都只有1个它们的酶切位点．限制酶EcoR I处理，凝胶上3.0 kb的片段消失，产生一种1.5 kb的新片段，说明在这段DNA正中间含有一个EcoR I酶酶切位点，综合表格信息可知该DNA片段共有7.7kb，在2.5kb处有HindⅢ酶切位点，在5.5kb处有Sma I酶切位点，在4.0kb处有EcoR I酶切位点，因此用限制酶HindⅢ和EcoR I将该线性DNA分子进行切割，可得到2.5 kb、1.5 kb、3.5 kb的片段．
故答案：
（1）限制性核酸内切酶 胰蛋白 31/32
（2）RNA RAS蛋白质
（3）环状
（4）1、1 2.5 kb、1.5 kb、3.5 kb
利用转基因奶牛乳腺生物发应器生产人的生长激素，需要构建一种能高水平表达的表达载体，选择合适的基因启动子至关重要．由于无法由基因表达产物推知启动子的碱基序列，运用PCR技术单独克隆启动子存在困难．科研人员经过长期研究，终于发明了下图所示的一种克隆启动子的方法．请回答：
（1）培育转基因奶牛时，需要在生长激素编码序列前插入______的启动子．
（2）由基因表达产物无法推知启动子碱基序列，其原因是______．
（3）过程①需选择的限制酶是______，过程③需选择的限制酶是______．过程④需要使用的工具酶是______．
（4）过程④中可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列设计______进行扩增．扩增过程中，在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
（5）过程⑤中将克隆的启动子与外源基因编码序列连接时，原引物a所在的P片段的碱基对数目应是3的整数倍，目的是______．
正确答案
解：（1）培育转基因奶牛时，根据基因的选择性表达原理，需要在生长激素编码序列前插入乳腺蛋白基因的启动子，使生长激素编码序列只在乳腺组织细胞中表达．
（2）因为基因中启动子的碱基序列不能被转录，所以由基因表达产物无法推知启动子碱基序列．
（3）含有目的基因的外源DNA分子上含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ、MboⅠ、HindⅢ的识别序列和切割位点，但是用限制酶HindⅢ、MboⅠ和HindⅢ切割都会破坏目的基因，所以过程①应选择限制酶BamHⅠ．而限制酶BamHⅠ和MboⅠ的识别序列相同，所以过程③中要将基因表达载体中的目的基因切开，应选择位于目的基因上的另一个限制酶HindⅢ．过程④表示采用PCR技术体外扩增目的基因的过程，该过程在高温条件下进行，因此需要使用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）．
（4）过程④中可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列设计引物进行扩增．扩增过程中，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
（5）因为基因中相邻的3个碱基决定一个密码子，所以过程⑤中将克隆的启动子与外源基因编码序列连接时，原引物a所在的P片段的碱基对数目应是3的整数倍，目的是保证外源基因编码序列编码正确的氨基酸序列．
故答案为：
（1）乳腺蛋白基因
（2）基因中启动子的碱基序列不能被转录
（3）BamHⅠHindⅢ耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
（4）引物 三
（5）保证外源基因编码序列编码正确的氨基酸序列
解析
解：（1）培育转基因奶牛时，根据基因的选择性表达原理，需要在生长激素编码序列前插入乳腺蛋白基因的启动子，使生长激素编码序列只在乳腺组织细胞中表达．
（2）因为基因中启动子的碱基序列不能被转录，所以由基因表达产物无法推知启动子碱基序列．
（3）含有目的基因的外源DNA分子上含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ、MboⅠ、HindⅢ的识别序列和切割位点，但是用限制酶HindⅢ、MboⅠ和HindⅢ切割都会破坏目的基因，所以过程①应选择限制酶BamHⅠ．而限制酶BamHⅠ和MboⅠ的识别序列相同，所以过程③中要将基因表达载体中的目的基因切开，应选择位于目的基因上的另一个限制酶HindⅢ．过程④表示采用PCR技术体外扩增目的基因的过程，该过程在高温条件下进行，因此需要使用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）．
（4）过程④中可以根据基因编码序列两端的部分碱基序列设计引物进行扩增．扩增过程中，在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
（5）因为基因中相邻的3个碱基决定一个密码子，所以过程⑤中将克隆的启动子与外源基因编码序列连接时，原引物a所在的P片段的碱基对数目应是3的整数倍，目的是保证外源基因编码序列编码正确的氨基酸序列．
故答案为：
（1）乳腺蛋白基因
（2）基因中启动子的碱基序列不能被转录
（3）BamHⅠHindⅢ耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
（4）引物 三
（5）保证外源基因编码序列编码正确的氨基酸序列
图l、图2力获得生物新品种的过程示意图．请据图回答
（1）图2为获得抗虫棉技术的流程．A过程需要的酶有______．
图3为重组质粒的模式图，B过程在一般培养基中应加入______，
才能获得含重组质粒的土壤农杆菌．
（2）图2中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是______．C过程的培养基除含有必要营养物质外，还必须加入的激素是______．
（3）随着科技发展，获取目的基因的方法也越来越多，若图2中的“抗虫基因”是利用图l中的方法获取的，该方法称为______、______．图中①过程与细胞中DNA复制过程相比，该过程不需要______酶．
（4）离体棉花叶片组织经C、D、E成功地培育出了转基因抗虫植株，此过程涉及的细胞工程技术是______．
正确答案
解：（1）A表示基因表达载体的构建过程，首先要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组质粒，因此该过程需要限制酶和DNA连接酶；通过标记基因筛选含有重组质粒的受体细胞，该质粒的标记基因是卡那霉素抗性基因，因此可以用含有卡那霉素的培养基进行选择培养．
（2）由图可知该过程借助农杆菌侵染离体棉花组织，将目的基因导入受体细胞，即农杆菌转化法；植物组织培养过程需要加适量的生长素和细胞分裂素促进根和芽的分化．
（3）PCR （聚合酶链式反应）是利用目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补配对，然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此循环往复，与细胞中DNA复制过程相比，该过程不需要DNA解旋酶．
（4）由图可知该过程涉及的细胞工程技术为植物组织培养技术．
故答案：（1）限制性内切酶、DNA连接酶 卡那霉素
（2）农杆菌转化法 生长素和细胞分裂素
（3）PCR DNA解旋酶
（4）植物组织培养
解析
解：（1）A表示基因表达载体的构建过程，首先要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组质粒，因此该过程需要限制酶和DNA连接酶；通过标记基因筛选含有重组质粒的受体细胞，该质粒的标记基因是卡那霉素抗性基因，因此可以用含有卡那霉素的培养基进行选择培养．
（2）由图可知该过程借助农杆菌侵染离体棉花组织，将目的基因导入受体细胞，即农杆菌转化法；植物组织培养过程需要加适量的生长素和细胞分裂素促进根和芽的分化．
（3）PCR （聚合酶链式反应）是利用目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补配对，然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸，如此循环往复，与细胞中DNA复制过程相比，该过程不需要DNA解旋酶．
（4）由图可知该过程涉及的细胞工程技术为植物组织培养技术．
故答案：（1）限制性内切酶、DNA连接酶 卡那霉素
（2）农杆菌转化法 生长素和细胞分裂素
（3）PCR DNA解旋酶
（4）植物组织培养
我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质．如图为培育转基因水稻过程示意图，请回答：
（1）在上述工程中，铁结合蛋白基因称为______，获取该基因后常用______技术进行扩增．
（2）构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制酶分别切割______和______．将重组Ti质粒转入农杆菌，可以用______处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入．
（3）将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得______；培养基3与培养基2的区别是______．
（4）检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻______．
正确答案
解：（l）获取目的基因的方法有三种：①从基因文库中获取 ②利用PCR技术扩增 ③人工合成（化学合成）．为了培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，所以铁结合蛋白基因称为目的基因，获取该基因后常用PCR技术进行扩增．
（2）构建重组质粒的过程中，通常要用同一种限制酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，使它们产生相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶连接成重组质粒．将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用CaCl2溶液处理农杆菌，使农杆菌属于感受态，便于重组Ti质粒导入．
（3）质粒上的标记基因为潮霉素抗性基因，因此通过培养基2的筛选培养，可以获得含有重组质粒的愈伤组织．愈伤组织再分化形成植株过程中需要加入生长素和细胞分裂素，生长素比例高时可促进生的分化，细胞分裂素比例高时可促进芽的分化，因此培养基3与培养基2的区别是生长素和细胞分裂素的浓度比例不同．
（4）该基因工程的目的基因为铁结合蛋白基因，因此检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻种子中铁含量．
故答案为：
（1）目的基因 PCR
（2）含目的基因的DNA片段 质粒 CaCl2
（3）含有重组质粒的愈伤组织 生长素和细胞分裂素的浓度比例
（4）种子中铁含量
解析
解：（l）获取目的基因的方法有三种：①从基因文库中获取 ②利用PCR技术扩增 ③人工合成（化学合成）．为了培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，所以铁结合蛋白基因称为目的基因，获取该基因后常用PCR技术进行扩增．
（2）构建重组质粒的过程中，通常要用同一种限制酶分别切割质粒和含目的基因的DNA片段，使它们产生相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶连接成重组质粒．将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用CaCl2溶液处理农杆菌，使农杆菌属于感受态，便于重组Ti质粒导入．
（3）质粒上的标记基因为潮霉素抗性基因，因此通过培养基2的筛选培养，可以获得含有重组质粒的愈伤组织．愈伤组织再分化形成植株过程中需要加入生长素和细胞分裂素，生长素比例高时可促进生的分化，细胞分裂素比例高时可促进芽的分化，因此培养基3与培养基2的区别是生长素和细胞分裂素的浓度比例不同．
（4）该基因工程的目的基因为铁结合蛋白基因，因此检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻种子中铁含量．
故答案为：
（1）目的基因 PCR
（2）含目的基因的DNA片段 质粒 CaCl2
（3）含有重组质粒的愈伤组织 生长素和细胞分裂素的浓度比例
（4）种子中铁含量
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