- 基因表达载体构建
- 共1561题
如图图一是利用基因工程生产人胰岛素的主要流程图，图二是生产过程中所制备的带有目的基因供体DNA分子及载体（质粒）的示意图．箭头所指为相应限制性核酸内切酶的识别位点，Tetr表示四环素抗性基因，Tetr上游有基因C，只有存在基因C的表达产物时Tetr基因才能表达．请回答下列问题：
（1）图一中的供体细胞是______．
（2）图一中第②步中需要的酶是______，第③步中需要的工具酶是______，第④步常用钙离子处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收周围DNA的______态．
（3）若图一所示过程中以Tetr为标记基因，则第③步中应选用______对供体DNA和质粒进行切割；为检测转化结果，将经第④步处理后的大肠杆菌培养液接种到含有______培养基上，长出的菌落就是成功插入目的基因的菌落．
（4）检测目的基因能否在大肠杆菌细胞中表达，常用的方法为______．
正确答案
解：（1）分析图解可以看出，图一中的供体细胞是人的某种体细胞．
（2）图一中第②步表示逆转录过程，该过程需要逆转录酶，基因表达载体的构建过程中需要限制酶和DNA连接酶，第④步常用钙离子处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收周围DNA的感受态．
（3）只有存在基因C的表达产物时Tetr基因才能表达，因此若图一所示过程中以Tetr为标记基因，则第③步中应选用SmaⅠ和PstⅠ对供体DNA和质粒进行切割，这样可以保证C基因的正常表达；标记基因是四环素抗性基因，所以在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌．
（4）检验目的基因在烟草细胞中是否成功表达的方法是抗原-抗体杂交．
故答案为：
（1）人的某种体细胞
（2）反转录酶（逆转录酶） 限制酶和DNA连接酶 感受
（3）SmaⅠ和PstⅠ四环素
（4）抗原-抗体杂交法
解析
解：（1）分析图解可以看出，图一中的供体细胞是人的某种体细胞．
（2）图一中第②步表示逆转录过程，该过程需要逆转录酶，基因表达载体的构建过程中需要限制酶和DNA连接酶，第④步常用钙离子处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收周围DNA的感受态．
（3）只有存在基因C的表达产物时Tetr基因才能表达，因此若图一所示过程中以Tetr为标记基因，则第③步中应选用SmaⅠ和PstⅠ对供体DNA和质粒进行切割，这样可以保证C基因的正常表达；标记基因是四环素抗性基因，所以在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌．
（4）检验目的基因在烟草细胞中是否成功表达的方法是抗原-抗体杂交．
故答案为：
（1）人的某种体细胞
（2）反转录酶（逆转录酶） 限制酶和DNA连接酶 感受
（3）SmaⅠ和PstⅠ四环素
（4）抗原-抗体杂交法
图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp如即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列．现有MspⅠ、BamHⅠ、BboI、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，酶切位点分别为cC↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG．请回答下列问题：
（1）图1中目的基因D的一条脱氧核苷酸链中相邻两个脱氧核苷酸之间是通过______键连接的，它是DNA复制时由______催化形成的．
（2）若用限制酶MboI完全切割图1中DNA片段，则产物中至少有______种不同DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被碱基对被T-A碱基对替换，再用限制酶Sma I完全切割，其产物长度分别为______．
（3）为了提髙实验成功率，需要获取大量目的基因D，可通过______技术对图1中的DNA分子进行扩增．
（4）若用同种限制酶处理图1、图2中两种分子，以便构建重组质粒，最好选用的限制酶是______，若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，先用______处理大肠杆菌，使之转变成感受态细胞．为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般先用添加含有抗生素______的培养基进行培养．
正确答案
解：（1）DNA一条脱氧核苷酸链中相邻两个脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接的，它是DNA复制时由DNA聚合酶催化形成的．
（2）图1中至少含有2个限制酶MboⅠ的识别序列（↓GATC），因此用限制酶MboⅠ完全切割图1中DNA片段，产物中至少有3种不同的DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，基因D就突变为基因d，那么基因d上只有一个限制酶SmaⅠ切割位点，被限制酶SmaⅠ切割的产物长度为534+796-3=1327kb、658+3=661bp．
（3）PCR技术可在体外大量扩增目的基因，所以为了提髙实验成功率，需要获取大量目的基因D，可通过PCR技术对图1中的DNA分子进行扩增．
（4）由图1可知，目的基因两侧是GGATCC序列，该序列是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将质粒和目的基因D连接形成重组质粒，应选用限制酶BamHⅠ切割．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，先用钙离子处理大肠杆菌，使之转变成感受态细胞．用限制酶BamHⅠ切割质粒后，破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因．因此，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般先用添加含有抗生素B的培养基进行培养．
故答案为：
（1）磷酸二酯键 DNA聚合酶
（2）3 1327bp、661bp
（3）PCR （多聚酶链式反应）
（4）BamHⅠ钙离子（Ca2+） B
解析
解：（1）DNA一条脱氧核苷酸链中相邻两个脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接的，它是DNA复制时由DNA聚合酶催化形成的．
（2）图1中至少含有2个限制酶MboⅠ的识别序列（↓GATC），因此用限制酶MboⅠ完全切割图1中DNA片段，产物中至少有3种不同的DNA片段；若图1中虚线方框内的碱基对被T-A碱基对替换，基因D就突变为基因d，那么基因d上只有一个限制酶SmaⅠ切割位点，被限制酶SmaⅠ切割的产物长度为534+796-3=1327kb、658+3=661bp．
（3）PCR技术可在体外大量扩增目的基因，所以为了提髙实验成功率，需要获取大量目的基因D，可通过PCR技术对图1中的DNA分子进行扩增．
（4）由图1可知，目的基因两侧是GGATCC序列，该序列是限制酶BamHⅠ的识别序列，因此要将质粒和目的基因D连接形成重组质粒，应选用限制酶BamHⅠ切割．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，先用钙离子处理大肠杆菌，使之转变成感受态细胞．用限制酶BamHⅠ切割质粒后，破坏了抗生素A抗性基因，但没有破环抗生素B抗性基因．因此，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般先用添加含有抗生素B的培养基进行培养．
故答案为：
（1）磷酸二酯键 DNA聚合酶
（2）3 1327bp、661bp
（3）PCR （多聚酶链式反应）
（4）BamHⅠ钙离子（Ca2+） B
我国目前临床使用的乙肝疫苗大多为基因工程疫苗，其有效成分是一种叫做乙肝表面抗原的蛋白质（S蛋白，对应的基因为S基因），请回答下列问题．
（1）在这项技术中，S基因属于______．
（2）用______处理S基因和运载体，并用______使之结合，这里的DNA片段两两结合的产物有______种，除了S基因，构建好的表达载体还应具有______等结构．
（3）将表达载体导入哺乳动物细胞，筛选得到工程细胞．使用合成培养基培养工程细胞时，通常需要加入______等天然成分．工程细胞在生长过程中有______现象，需要定期使用______酶处理，以便于分瓶继续培养，在培养过程中，定期收集培养液，分离纯化即可得到所需产品．
正确答案
解：（1）在基因工程技术中，S基因属于目的基因．
（2）在基因表达载体构建的过程中，要用同一种限制酶处理S基因和运载体，并用DNA连接酶使之结合．由于目的基因和运载体均具有相同黏性末端，因此这里的DNA片段两两结合的产物有目的基因自身连接、运载体自身连接和重组质粒3种．除了S基因，构建好的表达载体还应具有启动子、终止子、标记基因等结构．
（3）在对工程细胞进行动物细胞过程中，培养基中通常需要加入动物血清等天然成分．细胞在生长过程中有贴壁生长和接触抑制现象，需要定期使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使细胞分散，以便于分瓶继续培养，在培养过程中，定期收集培养液，分离纯化即可得到所需产品．
故答案为：
（1）目的基因
（2）同一种限制酶 DNA连接酶 3 启动子、终止子、标记基因
（3）动物血清 贴壁生长和接触抑制 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
解析
解：（1）在基因工程技术中，S基因属于目的基因．
（2）在基因表达载体构建的过程中，要用同一种限制酶处理S基因和运载体，并用DNA连接酶使之结合．由于目的基因和运载体均具有相同黏性末端，因此这里的DNA片段两两结合的产物有目的基因自身连接、运载体自身连接和重组质粒3种．除了S基因，构建好的表达载体还应具有启动子、终止子、标记基因等结构．
（3）在对工程细胞进行动物细胞过程中，培养基中通常需要加入动物血清等天然成分．细胞在生长过程中有贴壁生长和接触抑制现象，需要定期使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使细胞分散，以便于分瓶继续培养，在培养过程中，定期收集培养液，分离纯化即可得到所需产品．
故答案为：
（1）目的基因
（2）同一种限制酶 DNA连接酶 3 启动子、终止子、标记基因
（3）动物血清 贴壁生长和接触抑制 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
下图是利用基因工程和植物组织培养技术获得新植株的过程，请回答：
（1）图中A表示Ti质粒的______，切割A需要使用______．
（2）C→D过程需要使用______处理，使D处于______一种生理状态，这种细胞称为感受态细胞．
（3）培养E需要添加营养物质和植物激素，其目的是诱导细胞通过______过程发育为完整植株，培养要求无菌操作的原因是______．
（4）植株组织培养过程中，判断愈伤组织是否产生，依据是看是否产生了______的细胞．由愈伤组织再分化过程中需要光照，原因是______．
正确答案
解：（1）农杆菌的Ti质粒是拟核外环状DNA分子，分布在细菌细胞的细胞质，图中A表示Ti质粒的T-DNA；切割A需要使用限制性内切酶．
（2）将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即常用Ca2+处理微生物细胞，使其成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞．
（3）培养E需要添加营养物质和植物激素，其目的是诱导细胞通过脱分化和再分化过程发育为完整植株；培养要求无菌操作的原因是杂菌的生长一方面会与目标培养物竞争营养，从而使其失去营养；另一方面会产生大量对目标培养物有害的物质，导致其不能正常生长甚至死亡．
（4）判断愈伤组织是否产生，依据是：看是否产生了排列疏松而无规则、高度液泡化的呈无定形状态的细胞．由愈伤组织再分化过程中需要光照，原因是叶肉细胞中的叶绿素的合成需要光照．
故答案为：
（1）T-DNA 限制酶
（2）Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子的
（3）脱分化和再分化 杂菌的生长一方面会与目标培养物竞争营养，从而使其失去营养；另一方面会产生大量对目标培养物有害的物质，导致其不能正常生长甚至死亡
（4）排列疏松，呈不定形状态、高度液泡化的薄壁 叶肉细胞中的叶绿素的合成需要光照
解析
解：（1）农杆菌的Ti质粒是拟核外环状DNA分子，分布在细菌细胞的细胞质，图中A表示Ti质粒的T-DNA；切割A需要使用限制性内切酶．
（2）将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法，即常用Ca2+处理微生物细胞，使其成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞．
（3）培养E需要添加营养物质和植物激素，其目的是诱导细胞通过脱分化和再分化过程发育为完整植株；培养要求无菌操作的原因是杂菌的生长一方面会与目标培养物竞争营养，从而使其失去营养；另一方面会产生大量对目标培养物有害的物质，导致其不能正常生长甚至死亡．
（4）判断愈伤组织是否产生，依据是：看是否产生了排列疏松而无规则、高度液泡化的呈无定形状态的细胞．由愈伤组织再分化过程中需要光照，原因是叶肉细胞中的叶绿素的合成需要光照．
故答案为：
（1）T-DNA 限制酶
（2）Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子的
（3）脱分化和再分化 杂菌的生长一方面会与目标培养物竞争营养，从而使其失去营养；另一方面会产生大量对目标培养物有害的物质，导致其不能正常生长甚至死亡
（4）排列疏松，呈不定形状态、高度液泡化的薄壁 叶肉细胞中的叶绿素的合成需要光照
（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的______处，DNA连接酶作用于______处．（填“a”或“b”）
（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的方法有______法、______法和______法．
（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用______技术，该技术的核心是______和______．
（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的______做探针进行分子杂交检测，又要用______方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性．
正确答案
解：（1）图中a表示磷酸二酯键，是限制酶的切割位点，也是DNA连接酶的连接位点；b表示氢键，是解旋酶的作用位点．
（2）将重组DNA分子导入植物细胞的常用方法有农杆菌转化法、基因枪法或花粉管通道法．
（3）将细胞培养成植株需要利用植物组织培养技术，该技术的主要步骤是脱分化和再分化，原理是植物细胞具有全能性．
（4）要确定耐盐转基因水稻是否培育成功，从分子水平上，需要用放射性同位素标记的耐盐基因做探针进行分子杂交检测；从个体水平上，又要用一定浓度的盐水浇灌方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性．
故答案为：
（1）a a
（2）农杆菌转化 基因枪 花粉管通道
（3）植物组织培养 脱分化 再分化
（4）耐盐基因（目的基因） 一定浓度的盐水浇灌（移裁到盐碱地中）
解析
解：（1）图中a表示磷酸二酯键，是限制酶的切割位点，也是DNA连接酶的连接位点；b表示氢键，是解旋酶的作用位点．
（2）将重组DNA分子导入植物细胞的常用方法有农杆菌转化法、基因枪法或花粉管通道法．
（3）将细胞培养成植株需要利用植物组织培养技术，该技术的主要步骤是脱分化和再分化，原理是植物细胞具有全能性．
（4）要确定耐盐转基因水稻是否培育成功，从分子水平上，需要用放射性同位素标记的耐盐基因做探针进行分子杂交检测；从个体水平上，又要用一定浓度的盐水浇灌方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性．
故答案为：
（1）a a
（2）农杆菌转化 基因枪 花粉管通道
（3）植物组织培养 脱分化 再分化
（4）耐盐基因（目的基因） 一定浓度的盐水浇灌（移裁到盐碱地中）
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