- PCR技术的基本操作和应用
- 共11题
请回答基因工程方面的有关问题：
（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。 图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_______。
②在第_______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第1组：_______； ②第2组：_______。
（3） PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的 功能，这是因为_______。
（4）用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb
即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。
正确答案
见解析。
解析
（1）①下图为人教版教材中的插图，查图可知，第二轮中含引物II（或考题中的引物A）比例为3/4，第三轮中占7/8，即所有DNA片段中，只有一个片段不含引物II，故推测在第四轮中，含引物II（或引物A）的比例为15/16。
②由于题图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此第一轮循环后，得到的两DNA片段中两条脱氧核苷酸链都不等长，通过自行绘图可推知，第二轮中亦不会出现等长的，需到第三轮（试试看吧，这就不画出了）。
（2）这一问，对考生而言，完全不知从何说起，因为没有哪个版本的高中生物教材有关于引物选择方面的介绍，唯高校网络资源中有不多的介绍：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：
1.引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
2.引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
5.引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
6.引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
如果能了解上述信息，或许可以分析题图中的碱基组成，查出如下不合理之处：
①引物I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物I’自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
（3） 据人教版教材相关介绍，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。
（4）据两种酶单独和联合切割的结果分析，EcoRV在质粒上有一个切点，Mbol在该质粒上有两个切点，以上三个切点不存在重叠现象，故可标注如下图：
知识点
克隆猪成功率较低，与早期胚胎细胞的异常凋亡有关。Bcl-2 基因是细胞凋亡抑制基因，用PCR 技术可以检测该基因转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程如图。
请回答：
（1）图中重组细胞的细胞核来自 细胞，早期胚胎移入受体子宫后继续发育，经桑椹胚、囊胚和 胚最终发育为克隆猪。
（2）在PCR 过程中可检测出cDNA 中Bcl-2 cDNA 的分子数，进而计算总mRNA 中Bcl-2 mRNA 的分子数，从而反映出Bcl-2 基因的转录水平。
①图中X 表示 过程。
②从基因组数据库中查询Bcl-2 mRNA 的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成 用于PCR 扩增，PCR 扩增过程第一轮循环的模板是 。
正确答案
（1）体原肠
（2）①反转录
②引物Bcl-2 cDNA
解析
（1）图中重组细胞的细胞核来自良种猪的体细胞，胚胎发育过程中囊胚继续发育形成原肠胚。
（2）以mRNA 为模板形成DNA 的过程为反转录（或逆转录）。PCR 扩增的前提是需要有一段已知的核苷酸片段，以便根据这一序列合成引物。图示可知，PCR 扩增过程第一轮循环的模板是以mRNA 为模板反转录形成的cDNA，因引物是依据Bcl-2 mRNA 的核苷酸序列合成，故模板实际是其中的Bcl-2 cDNA。
知识点
花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。
用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图。
据图回答下列问题：
（1）过程①所需的酶是 。
（2）过程②后，在显微镜下观察融合的活细胞中有供体的 存在，这一特征可作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压，其作用是 。原生质体经过 再生，进而分裂和脱分化形成愈伤组织。
（4）若分析再生植株的染色体变异类型，应剪取再生植株和 植株的根尖，通过 、 、染色和制片等过程制成装片，然后在显微镜下观察比较染色体的形态和数目。
（5）采用特异性引物对花椰菜和黑芥基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。下图是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR 扩增的结果。据图判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有 。
（6）对杂种植株进行 接种实验，可筛选出具有高抗性的杂种植株。
正确答案
答案：（1）纤维素酶和果胶酶
（2）叶绿体
（3）保持原生质体完整性细胞壁
（4）双亲（或花椰菜和黑芥） 解离漂洗
（5）1、2、4 （6）黑腐病菌
解析
（1）过程①表示原生质体的制备，要用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁
（2）用于融合的两个细胞，一个是黑芥苗的叶肉细胞，一个是花椰菜的根部细胞，其中供体细胞特有的结构是叶绿体，可通过观察叶绿体的有无作为初步筛选杂种细胞的标志。
（3）原生质体没有细胞壁的保护，需要加入适宜浓度的甘露醇以保证渗透压的稳定，以避免原生质体吸水或失水破坏原生质体的完整性；原生质体通过细胞壁杂声形成杂种细胞，进而形成愈伤组织。
（4）分析再生植株染色体变异类型，需要将再生植株细胞染色体和黑芥苗与花椰菜细胞中的染色体制片观察进行比较，制片的基本程序是解离、漂洗、染色、制片。
（5）根据图谱，花椰菜含有碱基对为300 和600 的DNA 片段，黑芥还有碱基对为1000、1300 和1500 的片段，再生植株3,只含有长度为300 和600 的片段，与花椰菜一致，1、2、4 既含有花椰菜DNA 片段，又含有黑芥DNA 片段，为杂种植株。
（6）对杂种植株接种黑腐病菌，能正常生长的即为具有高抗性的杂种植株。
知识点
关于高中生物学实验的基本原理，叙述不正确的是
正确答案
解析
噬菌体属于侵染细菌的病毒，它没有细胞结构，缺乏自主代谢机制，它的生命活动离不开宿主细胞，故噬菌体繁殖必须在细菌中才能进行。提取DNA利用了不同化合物在溶剂中的溶解度不同和DNA在不同浓度的氯化钠溶液中溶解度不同的原理进行。细胞壁属于全透性的，成熟植物细胞在高渗溶液中发生质壁分离原因是原生质层具有选择透过性。PCR扩增DNA的原理是DNA复制，上一轮复制得到子代DNA可为下一轮DNA复制提供模板。
知识点
嗜热土壤芽胞杆菌产生的β-葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：
一，.利用大肠杆菌表达BglB酶
（1）PCR扩增bglB基因时，选用 基因组DNA作模板。
（2）右图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入 和 不同限制酶的识别序列。
（3）大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为 。
二，.温度对BglB酶活性的影响
（4）据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会 ；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在 （单选）。
a，50℃
b，60℃
c，70℃
d，80℃
三，.利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性
在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率。经过筛选，可获得能表达出热稳定性高的BglB酶的基因。
（5）与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽胞杆菌相比，上述育种技术获得热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中 （多选）。
A.仅针对bglB基因进行诱变
B.bglB基因产生了定向突变
C.bglB基因可快速累积突变
D.bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变
正确答案
（1）嗜热土壤芽孢杆菌
（2）NdeⅠ BamHⅠ
（3）转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶
（4）失活 b
（5）A、C
解析
略
知识点
新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术（或仪器）与应用匹配正确的是
正确答案
解析
略
知识点
3.关于DNA的实验，叙述正确的是（ ）
正确答案
解析
解析已在路上飞奔，马上就到！
知识点
玉米是重要的粮食作物，经深加工可生产酒精、玉米胚芽油和果糖等。流程如下：
（1）玉米秸秆中的纤维素经充分水解后的产物可被酵母菌利用发酵生产酒精。培养酵母菌时，该水解产物为酵母菌的生长提供________。发酵过程中检测酵母菌数量可采用________法或稀释涂布平板法计数。
（2）玉米胚芽油不易挥发，宜选用________法或________法从玉米胚芽中提取。
（3）玉米淀粉经酶解形成的葡萄糖可在葡萄糖异构酶的作用下转化成果糖。利用________技术可使葡萄糖异构酶重复利用，从而降低生产成本。
（4）利用PCR技术扩增葡萄糖异构酶基因时，需用耐高温的________催化。PCR一般要经历三十次以上的循环，每次循环包括变性、________和________三步。
正确答案
（1）碳源；显微镜直接计数
（2）压榨；萃取（注：两空可颠倒）
（3）固定化酶
（4）（Taq）DNA聚合酶；（低温）复性（或退火）；（中温）延伸
解析
略。
知识点
地中海贫血症属于常染色体遗传病。一对夫妇生有一位重型β地中海贫血症患儿，分析发现，患儿血红蛋白β链第39位氨基酸的编码序列发生了突变（C→T）。用PCR扩增包含该位点的一段DNA片段l，突变序列的扩增片段可用一种限制酶酶切为大小不同的两个片段m和s；但正常序列的扩增片段不能被该酶酶切，如图11（a）。目前患儿母亲再次怀孕，并接受了产权基因诊断。家庭成员及胎儿的PCR扩增产物酶切电泳带型示意图见图11（b）。（终止密码子为UAA、UAG、UGA。）
（1）在获得单链模板的方式上，PCR扩增与体内DNA复制不同，前者通过__________解开双链，后者通过________解开双链。
（2）据图分析，胎儿的基因型是_______（基因用A、a表示）。患儿患病可能的原因是_________的原始生殖细胞通过_______________过程产生配子时，发生了基因突变；从基因表达水平分析，其患病是由于_____________。
（3）研究者在另一种贫血症的一位患者β链基因中检测到一个新的突变位点，该突变导致β链第102位的天冬酰胺替换为苏氨酸。如果____________，但____________，则为证明该突变位点就是这种贫血症的致病位点提供了一个有力证据。
正确答案
（1）高温 解旋酶
（2）Aa 母亲 减数分裂 突变后终止密码子提前出现，翻译提前终止形成异常蛋白
（3）该病可遗传给后代 Ks5u 患者的β链不能被限制性酶切割
解析
（1）PCR是体外扩增DNA的方式，通过高温的使双链解开，体内DNA的复制则是通过解旋酶使DNA双链解开。Ks5u
（2）由题意可知重度β地中海贫血是隐性遗传病，突变后的序列可以被剪切成m和s的两个片段，而正常序列无法被剪切，因此母亲、父亲、患儿和胎儿的基因型分别为：AA、Aa、aa和Aa，母亲和父亲的基因型为AA和Aa，生下患儿可能是因此母亲的原始生殖细胞通过减数分裂产生配子时发生了基因突变。由图可知，其突变为由模板链的CTC突变成ATC，mRNA上由GAG变成UAG，因此终止密码子提前出现，使翻译提前终止。
如果这种贫血病可以遗传给后代，而又能证实不是重型地中海贫血，即β链不能被限制性酶切割，则为证明该突变位点就是这种贫血病的致病点提供了有力证据。
知识点
23.下列关于实验现象与结果的分析，错误的是（ ）
A.组织切片上滴加苏丹Ⅲ染液，显微观察有橘黄色颗粒说明有脂肪
B.组织样液中滴加斐林试剂，不产生砖红色沉淀说明没有还原糖
C.洋葱表皮细胞滴加蔗糖溶液后，发生质壁分离说明细胞有活性
D.PCR 产物中加入二苯胺试剂，加热变蓝说明有目的 DNA 产生
正确答案
BD
解析
解析已在路上飞奔，马上就到！
知识点
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