- 基因工程的基本操作程序
- 共6244题
拟南芥是遗传学研究的模式植物，某突变体可用于验证相关的基因的功能．野生型拟南芥的种皮为深褐色（TT），某突变体的种皮为黄色（tt），如图是利用该突变体验证油菜种皮颜色基因（Tn）功能的流程示意图．
（1）进行油菜Tn基因扩增时，下列引物是否合理，并说明理由______．
（2）若②不能在含抗生素A的培养基上生长，其原因是______；若用右图所示方法筛选出②，则符合要求的是图申的______．
（3）假设该油菜Tn基因连接到拟南芥染色体并替换其中一个t基因，则③进行减数分裂产生的配子基因型为______；同时，③的叶片卷曲（叶片正常对叶片卷曲为显性，且与种皮性状独立遗传），用它与种皮深褐色、时片正常的双杂合体拟南芥杂交，其后代中新表现类型所占比例为______．
正确答案
解：（1）因为引物Ⅱ自身末端会发生碱基互补配对，所以进行油菜Tn基因扩增时，不能用图中引物．
（2）重组质粒含有抗生素A抗性基因，但抗生素B抗性基因被破坏，所以导入重组质粒的农杆菌能在含有抗生素A的培养基上生长，不能在含抗生素B的培养基上生长，所以符合要求的是图中b、c．不能在含有抗生素A的培养基上生长的是未能导入重组质粒的农杆菌．
（3）假设该油菜Tn基因连接到拟南芥染色体并替换其中一个t基因，则该拟南芥植株的基因型为Tnt，根据基因的分离定律，该个体进行减数分裂能产生2种配子，其基因型为Tn和t；用它与种皮深褐色、时片正常的双杂合体拟南芥杂交，根据基因自由组合定律，其后代中新表现类型所占比例为1/4．
故答案：（1）不合理，引物Ⅱ自身末端会发生碱基互补配对
（2）未能导入重组质粒 b、c
（3）Tn和t 1/4
解析
解：（1）因为引物Ⅱ自身末端会发生碱基互补配对，所以进行油菜Tn基因扩增时，不能用图中引物．
（2）重组质粒含有抗生素A抗性基因，但抗生素B抗性基因被破坏，所以导入重组质粒的农杆菌能在含有抗生素A的培养基上生长，不能在含抗生素B的培养基上生长，所以符合要求的是图中b、c．不能在含有抗生素A的培养基上生长的是未能导入重组质粒的农杆菌．
（3）假设该油菜Tn基因连接到拟南芥染色体并替换其中一个t基因，则该拟南芥植株的基因型为Tnt，根据基因的分离定律，该个体进行减数分裂能产生2种配子，其基因型为Tn和t；用它与种皮深褐色、时片正常的双杂合体拟南芥杂交，根据基因自由组合定律，其后代中新表现类型所占比例为1/4．
故答案：（1）不合理，引物Ⅱ自身末端会发生碱基互补配对
（2）未能导入重组质粒 b、c
（3）Tn和t 1/4
常见的酿酒酵母能利用葡萄糖，不能利用木糖发酵．若用转基因技术将发酵木糖的关键基因--木糖还原酶（XYL1）或木糖异构酶基因（XYLA）转入酿酒酵母中，均能培育出能利用木糖发酵产生酒精的酿酒酵母．图表示XYL1基因与细菌pYMILP质粒重组的过程示意图．图中AMPr是氨苄青霉素抗性基因，其基因产物可使“碘-淀粉”复合物脱色，从而在含有“碘-淀粉”的固体平板上形成透明圈．转化成功的酿酒酵母中含AMPr基因的重组质粒拷贝数越多，透明圈越大．
（1）据图1可知，目的基因的长度是______bp；图中获取目的基因和切割质粒所用的限制性核酸内切酶分别是______、______，最终能形成重组质粒的原因是______．
（2）图2是四个成功导入重组质粒的酵母菌的菌株（品系），在“碘-淀粉”的固体平板上的生长情况，其中目的基因表达量最高的是______，根据题意，分析原因是______此“碘-淀粉”培养基从功能上看属于______培养基．
（3）图3是不同温度条件下重组酿酒酵母菌株的木糖异构酶活性．据图推测，此酶最初来自于______
A．嗜热细菌 B．大肠杆菌 C．葡萄球菌 D．乳酸杆菌．
正确答案
解：（1）分析图1可以看出，质粒的长度是9117bp，重组质粒的长度是10090bp，所以目的基因的长度是10090-9117=973bp；获取目的基因和切割质粒所用的限制性核酸内切酶分别是BamHI和BglⅡ，用限制性内切酶切割以后，可以形成相同的粘性末端，具有相同粘性末端的目的基因和质粒可以形成重组质粒．
（2）转化成功的酿酒酵母中含AMPr基因的重组质粒拷贝数越多，透明圈越大，所以2号目的基因的表达量最高．“碘-淀粉”培养基从功能上看属于选择培养基．
（3）由图3可以看出，木糖异构酶活性的最适温度大于80℃，温度较高，说明该酶最初来自嗜热细菌．
故答案为：
（1）973bp BamHI，BglⅡ，两种酶切后具有相同的粘性末端
（2）2，透明圈越大说明含AMPr 基因的重组质粒拷贝数越多，目的基因数量就越多，表达量越高 选择
（3）A
解析
解：（1）分析图1可以看出，质粒的长度是9117bp，重组质粒的长度是10090bp，所以目的基因的长度是10090-9117=973bp；获取目的基因和切割质粒所用的限制性核酸内切酶分别是BamHI和BglⅡ，用限制性内切酶切割以后，可以形成相同的粘性末端，具有相同粘性末端的目的基因和质粒可以形成重组质粒．
（2）转化成功的酿酒酵母中含AMPr基因的重组质粒拷贝数越多，透明圈越大，所以2号目的基因的表达量最高．“碘-淀粉”培养基从功能上看属于选择培养基．
（3）由图3可以看出，木糖异构酶活性的最适温度大于80℃，温度较高，说明该酶最初来自嗜热细菌．
故答案为：
（1）973bp BamHI，BglⅡ，两种酶切后具有相同的粘性末端
（2）2，透明圈越大说明含AMPr 基因的重组质粒拷贝数越多，目的基因数量就越多，表达量越高 选择
（3）A
（2015秋•大兴区期末）布鲁氏病是一种人畜共患的传染病，由布鲁氏杆菌（一种胞内寄生菌）所致．S19疫苗是预防布鲁氏病的普通疫苗，研究人员又研制了一种新型疫苗--DNA疫苗．
（1）研究人员将布鲁氏杆菌相关蛋白BCSP31的基因与______连接，注射到实验小鼠体内，在某些体细胞将内目的基因转录，再以______为原料翻译出BCSP31蛋白，该蛋白作为______刺激小鼠，产生免疫反应．
（2）实验过程中，研究人员将生长发育情况一致的小鼠随机分为四组，第1组注射用缓冲液配置的DNA疫苗50ug，第2组注射______作为对照，第3组注射等量缓冲液配置的空质粒作为对照，第4组注射______作为空白对照．
（3）给上述四组小鼠接种等量的布鲁氏杆菌，检测、记录小鼠的相关指标，结果如表：
根据结果分析，DNA疫苗组小鼠______，说明DNA疫苗具有一定的免疫保护作用．小鼠接种布鲁氏杆菌后，______细胞迅速增殖、分化，产生大量抗体，从而起到免疫保护作用．实验结果表明清除布鲁氏杆菌需要机体______免疫起作用．
正确答案
解：（1）构建目的基因表达载体是将目的基因和运载体重新组合成重组DNA分子，之后导入到受体细胞．蛋白质的基本单位是氨基酸．因此需要以氨基酸为原料翻译出BCSP31蛋白，该蛋白作为抗原刺激小鼠，产生免疫反应．
（2）对照实验，遵循对照原则和单一原则，第1组注射用缓冲液配置的DNA疫苗50ug，第2组注射用缓冲液配置的S19疫苗50ug（等量的用缓冲液配置的S19疫苗）作为对照S19疫苗自身影响因素，排除第3组注射等量缓冲液配置的空质粒作为对照，需要一组等量缓冲液作空间对照组，排除缓冲液的影响作用．
（3）据表数据分析，DNA疫苗组小鼠单位体积脾脏细菌数明显低于第四组，抗体和效应T细胞的相对数值明显高于第四组，说明DNA疫苗具有一定的免疫保护作用．布鲁氏杆菌是一种胞内寄生菌，当小鼠接种布鲁氏杆菌后，消灭它需要首先依靠细胞免疫起作用，将靶细胞裂解，记忆（B）细胞接受到抗原的刺激，会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，从而产生大量的抗体，通过体液免疫起作用．
故答案为：
（1）运载体（或质粒） 氨基酸 抗原
（2）用缓冲液配置的S19疫苗50ug（等量的用缓冲液配置的S19疫苗） 缓冲液50ug（或等量的缓冲液）
（3）单位体积脾脏细菌数明显低于第四组，抗体和效应T细胞的相对数值明显高于第四组 记忆（B） 体液免疫和细胞免疫
解析
解：（1）构建目的基因表达载体是将目的基因和运载体重新组合成重组DNA分子，之后导入到受体细胞．蛋白质的基本单位是氨基酸．因此需要以氨基酸为原料翻译出BCSP31蛋白，该蛋白作为抗原刺激小鼠，产生免疫反应．
（2）对照实验，遵循对照原则和单一原则，第1组注射用缓冲液配置的DNA疫苗50ug，第2组注射用缓冲液配置的S19疫苗50ug（等量的用缓冲液配置的S19疫苗）作为对照S19疫苗自身影响因素，排除第3组注射等量缓冲液配置的空质粒作为对照，需要一组等量缓冲液作空间对照组，排除缓冲液的影响作用．
（3）据表数据分析，DNA疫苗组小鼠单位体积脾脏细菌数明显低于第四组，抗体和效应T细胞的相对数值明显高于第四组，说明DNA疫苗具有一定的免疫保护作用．布鲁氏杆菌是一种胞内寄生菌，当小鼠接种布鲁氏杆菌后，消灭它需要首先依靠细胞免疫起作用，将靶细胞裂解，记忆（B）细胞接受到抗原的刺激，会迅速增殖分化，产生大量的浆细胞，从而产生大量的抗体，通过体液免疫起作用．
故答案为：
（1）运载体（或质粒） 氨基酸 抗原
（2）用缓冲液配置的S19疫苗50ug（等量的用缓冲液配置的S19疫苗） 缓冲液50ug（或等量的缓冲液）
（3）单位体积脾脏细菌数明显低于第四组，抗体和效应T细胞的相对数值明显高于第四组 记忆（B） 体液免疫和细胞免疫
科学家将人的胰岛素基因与质粒重组后，导入牛的受精卵，并成功从牛奶中提取到了人胰岛素．请根据如下操作流程回答相关问题．（已知酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-．
（1）获取目的基因的主要途径包括直接提取和______．
（2）据图分析，在①②过程中．目的因需用______（填“酶I”或“酶Ⅱ”）进行切割．③过程常用的方法是______．检验重组载体导人是否成功需要利用基因I作为______．
（3）为了得到较多的卵细胞，可以对受体母牛注射适宜剂量的______；利用获能的精子进行体外受精后，经过培养至______期，再进行______，最终获得符合要求的个体．
（4）若希望通过转基因牛生产的胰岛素具有作用快、持续时间长等特点，则需要通过______技术对人的胰岛素基因进行设计．
正确答案
解：（1）获取目的基因的主要途径包括：直接提取和人工合成．
（2）酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可见限制酶Ⅱ也能识别酶I的识别序列并进行切割．①②表示基因表达载体的构建过程，该过程需用限制酶Ⅱ进行切割．③表示将重组质粒导入受体细胞（受精卵）的过程，该过程常用的方法是显微注射法，因为显微注射法是将目的基因导入受体细胞最有效的方法．构建基因表达载体时，基因I未被破坏，而基因Ⅱ被破坏，所以检验重组载体导人是否成功需要利用基因I作为标记基因．
（3）胚胎移植时，常对受体母牛注射适宜剂量的促性腺激素，使其同期发情，为胚胎移植进入受体提供相同的生理环境；体外受精后，受精卵需培养至桑椹胚或囊胚期，再进行胚胎移植，最终获得符合要求的个体．
（4）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．若希望通过转基因牛生产的胰岛素具有作用快、持续时间长等特点，则需要通过蛋白质工程技术对人的胰岛素基因进行设计．
故答案：（1）人工合成
（2）限制酶Ⅱ显微注射法 标记基因
（3）促性腺激素 桑椹胚或囊胚 胚胎移植
（4）蛋白质工程
解析
解：（1）获取目的基因的主要途径包括：直接提取和人工合成．
（2）酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，酶Ⅱ的识别序列和切点是-↓GATC-，可见限制酶Ⅱ也能识别酶I的识别序列并进行切割．①②表示基因表达载体的构建过程，该过程需用限制酶Ⅱ进行切割．③表示将重组质粒导入受体细胞（受精卵）的过程，该过程常用的方法是显微注射法，因为显微注射法是将目的基因导入受体细胞最有效的方法．构建基因表达载体时，基因I未被破坏，而基因Ⅱ被破坏，所以检验重组载体导人是否成功需要利用基因I作为标记基因．
（3）胚胎移植时，常对受体母牛注射适宜剂量的促性腺激素，使其同期发情，为胚胎移植进入受体提供相同的生理环境；体外受精后，受精卵需培养至桑椹胚或囊胚期，再进行胚胎移植，最终获得符合要求的个体．
（4）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．若希望通过转基因牛生产的胰岛素具有作用快、持续时间长等特点，则需要通过蛋白质工程技术对人的胰岛素基因进行设计．
故答案：（1）人工合成
（2）限制酶Ⅱ显微注射法 标记基因
（3）促性腺激素 桑椹胚或囊胚 胚胎移植
（4）蛋白质工程
回答下列关于基因工程的问题．
草甘膦是一种广谱除草剂，其除草机制是抑制植物体内EPSPS酶的合成，最终导致植物死亡．但是，它的使用有时也会影响到植物的正常生长．目前，已发现可以从一种抗草甘膦的大肠杆菌突变株中分离出EPSPS基因，若将该基因转入植物细胞内，从而获得的转基因植物就能耐受高浓度的草甘膦．
下图A-F表示6株植物，其中，植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，但是否成功还未知．图1和2分别表示两段DNA序列．表格中1-4分别表示4种限制性核酸内切酶的酶切位点．据图回答下列问题：
（1）若A-C浇清水，D-F浇的水中含有草甘膦，上述植物中，肯定能健康成长的是______．
（2）若要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株甲，在大肠杆菌培养基中还必须加入______．
（3）假设位于EPSPS基因两侧的DNA序列均如图I所示，则应选择表中酶______进行酶切；若位于EPSPS基因两侧的DNA序列分别如图I和II所示，则应选择表中酶______ 进行酶切．
（4）假设大肠杆菌突变菌株甲中EPSPS基因的右侧序列如图II所示，请在方框内画出经酶切后产生的两个末端的碱基序列．
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，但植物F仍没有表现出抗性，分析可能的原因______．
下图甲是某目的基因（4.0kb，1kb=1000对碱基）与大肠杆菌pUC18质粒（2.7kb）重组的示意图．图中Ap′是抗氨苄青霉素基因，lacZ是显色基因，其上的EcoRI识别位点位于目的基因插入位点的右侧，其控制合成的物质能使菌落呈现蓝色．（图乙中深色圆点即为蓝色菌落）
（6）图乙的培养基中含有氨苄青霉素，请判断图乙中所出现的白色和蓝色两种菌落中，何种会含有重组质粒．______．
（7）现用EcoRI酶切质粒，酶切后进行电泳观察，若出现长度为______kb和______kb的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功．（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRI的识别位点之间的碱基对忽略不计）
正确答案
解：（1）根据题意分析可知：植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，所以A-C浇清水，都能健康成长．F虽经过了转基因处理，但是否成功还未知，所以D-F浇的水中含有草甘膦，D肯定不能健康成长，E肯定能健康成长，F未知．因此肯定能健康成长的是ABCE．
（2）要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株，则必须要用含草甘膦的选择培养基培养大肠杆菌．
（3）因为限制酶具有特异性识别的能力，对照图1所示，所以应选择表中酶2进行酶切．对照图1和2所示，则应选择表中酶2和3同时进行酶切．
（4）画图要求：画出完整的DNA片段，要有两个黏性末端，化学键、碱基序列完整且正确．
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，说明F中已含有EPSPS基因，如果仍没有表现出抗性，则说明EPSPS基因在受体细胞中没有表达或表达的酶没有活性．
（6）白色，因为EcoRI将lacZ显色基因破坏了．
（7）目的基因被酶切后形成两个片段：1.0kb和3.0kb；质粒被酶切后长度不变：2.7kb．故质粒只能和目的基因片段之一发生重组，如果成功的话将会出现两种情况：3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb．
故答案为：
（1）ABCE （2）草甘膦 （3）2 2和3
（4）
（5）目的基因在受体细胞中没有表达，或表达的酶没有活性
（6）白色
（7）3.0和3.7或1.0和5.7
解析
解：（1）根据题意分析可知：植物A和D对草甘膦敏感，B和E对草甘膦天然具有抗性，C和F则经过了转基因处理，所以A-C浇清水，都能健康成长．F虽经过了转基因处理，但是否成功还未知，所以D-F浇的水中含有草甘膦，D肯定不能健康成长，E肯定能健康成长，F未知．因此肯定能健康成长的是ABCE．
（2）要从大肠杆菌中筛选出含EPSPS基因的突变菌株，则必须要用含草甘膦的选择培养基培养大肠杆菌．
（3）因为限制酶具有特异性识别的能力，对照图1所示，所以应选择表中酶2进行酶切．对照图1和2所示，则应选择表中酶2和3同时进行酶切．
（4）画图要求：画出完整的DNA片段，要有两个黏性末端，化学键、碱基序列完整且正确．
（5）假设EPSPS基因已被成功转移到植物F中，说明F中已含有EPSPS基因，如果仍没有表现出抗性，则说明EPSPS基因在受体细胞中没有表达或表达的酶没有活性．
（6）白色，因为EcoRI将lacZ显色基因破坏了．
（7）目的基因被酶切后形成两个片段：1.0kb和3.0kb；质粒被酶切后长度不变：2.7kb．故质粒只能和目的基因片段之一发生重组，如果成功的话将会出现两种情况：3kb和3.7kb或1.0kb和5.7kb．
故答案为：
（1）ABCE （2）草甘膦 （3）2 2和3
（4）
（5）目的基因在受体细胞中没有表达，或表达的酶没有活性
（6）白色
（7）3.0和3.7或1.0和5.7
【选修3-现代生物科技专题】
如图表示“华恢1号”抗虫水稻主要培育流程，据图回答：
（1）crylA基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做______；
（2）杀虫基因（crylA）是根据几种Bt毒蛋白的分子结构，设计并人工合成的，这属于______工程技术范畴．
（3）组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造．下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图（示部分基因及部分限制酶作用位点），据图分析：
①改造质粒时，要使抗虫基因能成功表达，还应插入______．
②改造质粒时用限制酶Ⅰ处理，其目的是：第一，去除质粒上的______（基因），保证T-DNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制酶作用位点，有利于______．第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等．
③若用限制酶Ⅱ分别切割经过②过程改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒，再分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是______．
（4）一个图所示的质粒分子在限制酶Ⅱ切割的前后，分别含有______个和______个游离的磷酸基团．
（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入______酶．
正确答案
解：（1）转化是指目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种心的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程．
（3）①启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质．
②限制酶Ⅰ的作用位点在tms 基因上，破坏了tms 基因的作用．另外只有一个作用位点，也有利于目的基因（或外源DNA）准确插入．
③限制酶Ⅱ分别切割质粒，破坏了tmr和tet基因，tet基因是四环素抗性基因．但卡那霉素抗性基因没有被破坏．重组Ti质粒，再分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．
（4）质粒为小型环状的DNA分子，环状DNA分子中没有游离的磷酸基团，经过限制酶Ⅱ切割后在切口处每端各含有1个游离的磷酸基团．限制酶Ⅱ切割图所示的质粒分子产生2个切口．
（5）含有目的基因的片段与质粒连接形成重组质粒，需要DNA连接酶将两个DNA片段的末端的“缝隙”连接起来．
故答案为：
（1）植物组织培养
（2）蛋白质
（3）①启动子 ②tms 目的基因（或外源DNA）准确插入 ③在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
（4）0、4
（5）DNA连接酶
解析
解：（1）转化是指目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程．
（2）蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种心的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要．蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程．
（3）①启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质．
②限制酶Ⅰ的作用位点在tms 基因上，破坏了tms 基因的作用．另外只有一个作用位点，也有利于目的基因（或外源DNA）准确插入．
③限制酶Ⅱ分别切割质粒，破坏了tmr和tet基因，tet基因是四环素抗性基因．但卡那霉素抗性基因没有被破坏．重组Ti质粒，再分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞，观察到的细胞生长的情况是在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．
（4）质粒为小型环状的DNA分子，环状DNA分子中没有游离的磷酸基团，经过限制酶Ⅱ切割后在切口处每端各含有1个游离的磷酸基团．限制酶Ⅱ切割图所示的质粒分子产生2个切口．
（5）含有目的基因的片段与质粒连接形成重组质粒，需要DNA连接酶将两个DNA片段的末端的“缝隙”连接起来．
故答案为：
（1）植物组织培养
（2）蛋白质
（3）①启动子 ②tms 目的基因（或外源DNA）准确插入 ③在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
（4）0、4
（5）DNA连接酶
如图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程．请据图回答下列有关问题：
（1）若限制酶l的识别序列和切点是
（2）将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有______的培养基，能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入，该培养基从功能方面属于选择培养基．
（3）重组质粒导人大肠杆菌的目的是______．
（4）经筛选分析该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子．理论上该转基因植株自交产生的F1代中，优具有抗虫特性且能稳定遗传的植株占总数的______．
（5）⑤过程所用技术称为_______，从遗传学角度来看，根本原因是根细胞具有______．
正确答案
解：（1）质粒中两个标记基因中均有限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，若用该酶切，抗性基因均被破坏，因此用限制酶Ⅱ切割质粒；目的基因可以用限制酶Ⅰ或两种酶一起切割，由于两种切割形成的末端序列相同，因此可以连接．
（2）用限制酶Ⅱ切割质粒，破坏了质粒中的氨苄青霉素抗性基因，因此标记基因是四环素抗性基因，所以应有含四环素的选择培养基上．
（3）由于大肠杆菌的繁殖快，周期短，因此将重组质粒导入大肠杆菌可以扩增目的基因．
（4）由于转基因植株可以看成杂合子（Aa），因此Aa×Aa，后代具有抗虫特性且能稳定遗传的植株（AA）占
（5）根据细胞的全能型（含有发育成完整个体的全部遗传物质），将以分化的根细胞培养成一棵植株，运用了植物组织培养技术．
故答案为：
（1）ⅡⅠ（Ⅰ和Ⅱ）
（2）四环素
（3）大量复制目的基因 （抗虫基因）
（4）1/4
（5）植物组织培养 发育成完整个体的全部遗传物质
解析
解：（1）质粒中两个标记基因中均有限制酶Ⅰ的识别序列和切点是-↓GATC-，若用该酶切，抗性基因均被破坏，因此用限制酶Ⅱ切割质粒；目的基因可以用限制酶Ⅰ或两种酶一起切割，由于两种切割形成的末端序列相同，因此可以连接．
（2）用限制酶Ⅱ切割质粒，破坏了质粒中的氨苄青霉素抗性基因，因此标记基因是四环素抗性基因，所以应有含四环素的选择培养基上．
（3）由于大肠杆菌的繁殖快，周期短，因此将重组质粒导入大肠杆菌可以扩增目的基因．
（4）由于转基因植株可以看成杂合子（Aa），因此Aa×Aa，后代具有抗虫特性且能稳定遗传的植株（AA）占
（5）根据细胞的全能型（含有发育成完整个体的全部遗传物质），将以分化的根细胞培养成一棵植株，运用了植物组织培养技术．
故答案为：
（1）ⅡⅠ（Ⅰ和Ⅱ）
（2）四环素
（3）大量复制目的基因 （抗虫基因）
（4）1/4
（5）植物组织培养 发育成完整个体的全部遗传物质
苏云金杆菌是一种对昆虫有毒害作用的细菌，其杀虫活性物质主要是一类伴孢晶 体蛋白．伴孢晶体蛋白经昆虫肠液消化成毒性肽，并因此导致昆虫死亡．自从培育转基因 植物抗虫棉成功后，研究人员又试图将抗虫基因导入水稻细胞中，从而培养出转基因抗虫 水稻．研究人员从相关生物体内提取出的部分物质或结构如下图所示：图1表示含有目的 基因（抗虫基因）的DWA片段长度（bp为碱基对）和部分碱基序列，图2表示作为运载体的 一种质粒的结构和部分碱基序列．现有Msp I，BamH I，Mbo ISma I 4种限制性核酸内切 酶，它们所识别的碱基序列和酶切位点（用“↓”表示）分别为C↓CGG．G↓ GATCCn↓； GATC、CCC↓ GGG．请回答下列问题：
（1）若用限制酶Sma I完全切割图1中所示DNA片段，则其产物有______种，长度分别为______．
（2）若将图2中质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是______．
（3 ）在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的水稻细胞，需配置相应培养基，其中添加的碳源是______，目的是提供营养和______．另外，培养基中除了含有必要营养物质、琼脂和激素外，一般还需要添加______（抗生素A/抗生素B），该培养基从用途上看属于______培养基．
（4）在培养过程中，除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，成功的另一个关键是操作过程必须保证无菌，镊子等器械及培养基都可使用的灭菌方法是______．
正确答案
解：（1）SmaⅠ识别的序列为GGGCCC，切割会产生平末端；图1中DNA片段含有两个SmaⅠ识别位点，第一个识别位点在左端534bp序列向右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658bp序列向左三个碱基的位置，从而两个位点切割后产生的DNA片段的长度分布为534+3，796-3-3，658+3，即得到的DNA片段长度为537、790、661．
（2）能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamHI和识别序列为GATC的MboI，若使用MboI会同时破坏质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamHI来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞．
（3 ）植物组织培养的培养基中添加的碳源是蔗糖，目的为提供营养和调节渗透压．培养基中一般还需要添加抗生素B，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞，从用途上看属于选择培养基．
（4）镊子等器械及培养基都可使用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌．
故答案为：
（1）3，537bp、790bp、661bp
（2）BamH I
（3）蔗糖，调节渗透压． 抗生素B，选择
（4）高压蒸汽灭菌
解析
解：（1）SmaⅠ识别的序列为GGGCCC，切割会产生平末端；图1中DNA片段含有两个SmaⅠ识别位点，第一个识别位点在左端534bp序列向右三个碱基对的位置；第二个识别位点在右端658bp序列向左三个碱基的位置，从而两个位点切割后产生的DNA片段的长度分布为534+3，796-3-3，658+3，即得到的DNA片段长度为537、790、661．
（2）能够获取目的基因并切开质粒的限制酶有识别序列为GGATCC的BamHI和识别序列为GATC的MboI，若使用MboI会同时破坏质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因，所以要用BamHI来切割目的基因和质粒，切割后保留了完整的抗生素B抗性基因，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞．
（3 ）植物组织培养的培养基中添加的碳源是蔗糖，目的为提供营养和调节渗透压．培养基中一般还需要添加抗生素B，便于筛选出含有重组质粒的受体细胞，从用途上看属于选择培养基．
（4）镊子等器械及培养基都可使用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌．
故答案为：
（1）3，537bp、790bp、661bp
（2）BamH I
（3）蔗糖，调节渗透压． 抗生素B，选择
（4）高压蒸汽灭菌
科学工作者利用基因工程研制出两种丙肝病毒疫苗，为检测两种疫苗的免疫效果，以小鼠为实验材料进行实验，实验处理及结果如下表：
注：“-”表示免疫应答效果不显著，“+”数目表示免疫应答效果的显著程度．
（1）制备疫苗的过程中首先要形成重组DNA分子，其过程是以分枝杆菌的______作为载体，目的基因来源于______（生物），用______限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体，形成相同的粘性末端，用______酶进行连接．再将该重组DNA分子直接导入分枝杆菌，可制成重组细菌疫苗．或者对该重组DNA分子进行修饰使其能在真核细胞内表达，可制成DNA疫苗．
（2）重组细菌进入小鼠的巨噬细胞内，利用______细胞的表达系统合成抗原蛋白．
（3）设置第2组和第4组作为对照，其目的是______．检测结果显示，未重组细菌和未重组空白载体______（能/不能）刺激机体产生体液免疫．
（4）每组实验需要接种3次，利用再次免疫具有______的特点，使实验结果更加显著．效应T细胞可来源于______．
（5）实验结论：
①______；
②______．
正确答案
解：
（1）常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．重组DNA分子，其过程是以分枝杆菌的质粒作为载体．本实验是利用基因工程研制出两种丙肝病毒疫苗，目的基因来源于丙肝病毒．用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，形成相同的粘性末端．再用DNA连接酶连接目的基因和载体粘性末端形成重组质粒．
（2）重组细菌进入小鼠的巨噬细胞内，重组细菌体内含的目的基因，利用分枝杆菌（或重组细菌）细胞的表达系统合成抗原蛋白，对小鼠进行侵染．
（3）2组接种未重组空白载体和4组接种未重组细菌，设置第2组和第4组作为对照，其目的是排除空白载体和未重组细菌的干扰．检测结果显示，未重组细菌和未重组空白载体两组处理后，淋巴细胞增殖、效应T细胞杀伤力、产生某种淋巴因子都较低，没有产生特异性抗体，说明不能刺激机体产生体液免疫．
（4）二次免疫调节特点是迅速并强烈．T细胞和记忆细胞受抗原刺激后分化成效应T细胞．
（5）3组和4组中两组处理后，淋巴细胞增殖、效应T细胞杀伤力、产生某种淋巴因子和产生特异性抗体都较高，说明两种疫苗都能诱导机体产生特异性免疫应答．4组处理后，效应T细胞杀伤力、产生某种淋巴因子和产生特异性抗体都比3组的高，说明重组细菌疫苗诱导机体产生特异性免疫应答的效果高于重组DNA疫苗．
故答案为：
（1）质粒 丙肝病毒 同种 DNA连接
（2）分枝杆菌（或重组细菌）
（3）排除空白载体和未重组细菌的干扰 不能
（4）迅速、强烈 T细胞和记忆细胞
（5）①两种疫苗都能诱导机体产生特异性免疫应答
②重组细菌疫苗诱导机体产生特异性免疫应答的效果高于重组DNA疫苗
解析
解：
（1）常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．重组DNA分子，其过程是以分枝杆菌的质粒作为载体．本实验是利用基因工程研制出两种丙肝病毒疫苗，目的基因来源于丙肝病毒．用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，形成相同的粘性末端．再用DNA连接酶连接目的基因和载体粘性末端形成重组质粒．
（2）重组细菌进入小鼠的巨噬细胞内，重组细菌体内含的目的基因，利用分枝杆菌（或重组细菌）细胞的表达系统合成抗原蛋白，对小鼠进行侵染．
（3）2组接种未重组空白载体和4组接种未重组细菌，设置第2组和第4组作为对照，其目的是排除空白载体和未重组细菌的干扰．检测结果显示，未重组细菌和未重组空白载体两组处理后，淋巴细胞增殖、效应T细胞杀伤力、产生某种淋巴因子都较低，没有产生特异性抗体，说明不能刺激机体产生体液免疫．
（4）二次免疫调节特点是迅速并强烈．T细胞和记忆细胞受抗原刺激后分化成效应T细胞．
（5）3组和4组中两组处理后，淋巴细胞增殖、效应T细胞杀伤力、产生某种淋巴因子和产生特异性抗体都较高，说明两种疫苗都能诱导机体产生特异性免疫应答．4组处理后，效应T细胞杀伤力、产生某种淋巴因子和产生特异性抗体都比3组的高，说明重组细菌疫苗诱导机体产生特异性免疫应答的效果高于重组DNA疫苗．
故答案为：
（1）质粒 丙肝病毒 同种 DNA连接
（2）分枝杆菌（或重组细菌）
（3）排除空白载体和未重组细菌的干扰 不能
（4）迅速、强烈 T细胞和记忆细胞
（5）①两种疫苗都能诱导机体产生特异性免疫应答
②重组细菌疫苗诱导机体产生特异性免疫应答的效果高于重组DNA疫苗
回答下列有关生物工程的问题．
下表是基因工程中几种限制酶识别序列及其切割位点；图2是转基因香蕉的培育过程，含目的基因的外源DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点．
（1）图1是用限制酶______进行切割得到的目的基因，可以防止含目的基因的外源DNA片段切割后______．
（2）从图2中反映质粒作为运载体的特点是______．基因工程中还可以用______作为运载体．
（3）图2中构建重组质粒不能使用SmaI酶切割的原因是______．
（4）图2中④表示组织培养过程中的______，它对植物激素调节的要求是______．
（5）图2中的农杆菌是基因工程中的______．判断该转基因工程是否成功的依据是______．
正确答案
解：（1）构建含目的基因的重组质粒A时，选用 BamHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，同理，也可以防止质粒自身环化．
（2）质粒作为运载体的特点是有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存；还常用噬菌体或动植物病毒（或病毒）作为运载体．
（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（4）图2中④表示组织培养过程中的脱分化，植物激素调节的要求是生长素与细胞分裂素浓度的比值约为1．
（5）图2中的农杆菌是基因工程中的含目的基因的受体；判断该转基因工程是否成功的依据是该目的基因在香蕉中是否成功表达．
故答案为：（1）BamH I和Hind III 自身环化
（2）有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存（至少写2点）噬菌体或动植物病毒（或病毒）
（3）SmaI酶会破坏目的基因和质粒
（4）去分化 生长素与细胞分裂素浓度的比值约为1
（5）含目的基因的受体 该目的基因在香蕉中是否成功表达．
解析
解：（1）构建含目的基因的重组质粒A时，选用 BamHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，同理，也可以防止质粒自身环化．
（2）质粒作为运载体的特点是有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存；还常用噬菌体或动植物病毒（或病毒）作为运载体．
（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（4）图2中④表示组织培养过程中的脱分化，植物激素调节的要求是生长素与细胞分裂素浓度的比值约为1．
（5）图2中的农杆菌是基因工程中的含目的基因的受体；判断该转基因工程是否成功的依据是该目的基因在香蕉中是否成功表达．
故答案为：（1）BamH I和Hind III 自身环化
（2）有多个酶切位点、有标记基因、能在宿主细胞内复制并稳定保存（至少写2点）噬菌体或动植物病毒（或病毒）
（3）SmaI酶会破坏目的基因和质粒
（4）去分化 生长素与细胞分裂素浓度的比值约为1
（5）含目的基因的受体 该目的基因在香蕉中是否成功表达．
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