- 基因工程的基本操作程序
- 共6244题
黄曲霉毒素AFB1存在于被黄曲霉菌污染的饲料中，它可以通过食物链进入动物体内并累积，引起癌变；某些微生物能表达AFB1解毒酶，将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性．
（1）AFB1属于______类致癌因子．
（2）黄曲霉毒素诱发肝癌发生的原理是基因突变．研究发现，黄曲霉毒素会导致p53基因（阻止细胞不正常增值的基因）失去正常功能，所以p53基因属于______基因（原癌、抑癌基因）；肝癌细胞容易分散和转移的原因是细胞表面的______等物质减少．
（3）如图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图．
①在甲、乙条件下培养含AFB1解毒酶基因的菌株．经测定，甲菌液细胞密度小、细胞含解毒酶；乙菌液细胞密度大、细胞不含解毒酶．过程I应选择______菌液的细胞提取总RNA，理由是______．
②过程Ⅱ中需两种引物（引物1、引物2），若过程Ⅱ循环5次，需引物1的个数是______．
③检测酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用______方法．
（4）选取不含AFB1的饲料和某种实验动物为材料，探究该AFB1解毒酶在饲料中的解毒效果．实验设计及测定结果见表，据表回答：
①本实验自变量为______．
②本实验中，反映AFB1解毒酶的解毒效果的对照组是______．
③经测定，某污染饲料中AFB1含量为100μg/kg，则每千克饲料应添加______克AFB1解毒酶，解毒效果最好，同时节约了成本．
（5）某医院为确诊一患者的肿瘤是良性还是恶性，切取了一小块肿瘤组织进行培养．培养之前，肿瘤组织必须先用______（酶）等处理成单个细胞．
正确答案
解：（1）黄曲霉毒素AFB1是一种化学物质，属于化学类致癌因子．
（2）引起癌变的基因有原癌基因和抑癌基因，抑癌基因主要是阻止细胞不正常的增殖，所以p53基因属于抑癌基因．肝癌细胞容易分散和转移的原因是细胞表面的糖蛋白等物质减少，细胞不能识别而导致的．
（3）①甲菌液细胞含解毒酶，说明完成了基因的表达，所以甲菌液含有合成AFB1解毒酶的mRNA模板，因此应选择甲菌液的细胞提取总RNA．
②过程Ⅱ为PCR技术，该过程中需两种引物（引物1、引物2），若过程Ⅱ循环5次，将产生25=32个子代DNA分子中，只有亲代DNA分子中不需要引物，因此需31个引物1．
③检测酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用抗原-抗体杂交方法．
（4）①本实验的两个自变量，分别为AFB1的有无和AFB1解毒酶的含量．
②本实验中．反映AFB1解毒酶的解毒效果的对照组是B组．
③经测定，某污染饲料中AFB1含量为100μg/kg，则每千克饲料应添加5克AFB1解毒酶．解毒效果最好．同时节的了成本．
（5）肿瘤组织在培养之前，必须先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使之分散成单个细胞，制成细胞悬液．
故答案为：
（1）化学
（2）抑癌 糖蛋白
（3）①甲 甲菌液细胞的AFB1解毒酶基因已转录生成了mRNA，而在乙菌液细胞中该基因未转录
②31 ③抗原-抗体杂交
（4）①AFB1的有无和AFB1解毒酶的含量 ②B组 ③5
（5）胰蛋白酶
解析
解：（1）黄曲霉毒素AFB1是一种化学物质，属于化学类致癌因子．
（2）引起癌变的基因有原癌基因和抑癌基因，抑癌基因主要是阻止细胞不正常的增殖，所以p53基因属于抑癌基因．肝癌细胞容易分散和转移的原因是细胞表面的糖蛋白等物质减少，细胞不能识别而导致的．
（3）①甲菌液细胞含解毒酶，说明完成了基因的表达，所以甲菌液含有合成AFB1解毒酶的mRNA模板，因此应选择甲菌液的细胞提取总RNA．
②过程Ⅱ为PCR技术，该过程中需两种引物（引物1、引物2），若过程Ⅱ循环5次，将产生25=32个子代DNA分子中，只有亲代DNA分子中不需要引物，因此需31个引物1．
③检测酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，应采用抗原-抗体杂交方法．
（4）①本实验的两个自变量，分别为AFB1的有无和AFB1解毒酶的含量．
②本实验中．反映AFB1解毒酶的解毒效果的对照组是B组．
③经测定，某污染饲料中AFB1含量为100μg/kg，则每千克饲料应添加5克AFB1解毒酶．解毒效果最好．同时节的了成本．
（5）肿瘤组织在培养之前，必须先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使之分散成单个细胞，制成细胞悬液．
故答案为：
（1）化学
（2）抑癌 糖蛋白
（3）①甲 甲菌液细胞的AFB1解毒酶基因已转录生成了mRNA，而在乙菌液细胞中该基因未转录
②31 ③抗原-抗体杂交
（4）①AFB1的有无和AFB1解毒酶的含量 ②B组 ③5
（5）胰蛋白酶
多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果胶使细胞壁破损．成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜． 利用第基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期．科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如图．据图回答下列问题：
（1）若已获取PG的mRNA，可通过______获取PG基因．
（2）改造过程需要用到的工具有______，若得到的目的基因两侧需人工合成BamHⅠ黏性末端，己知BamHⅠ的识别序列如下图甲所示，请在答题纸上图乙相应位置画出目的基因两侧的黏性末端．
（3）在该基因上游加结构A可确保基因的反义转录，结构A上应具有______酶结合位点，在该番茄新品种的培育过程中，将目的基因导入受体细胞的方法叫做______．
（4）用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有______的培养基进行筛选．之后还需将其置于质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞______现象来鉴别细胞壁是否再生．
（5）将转入反向链接PG基因的番茄细胞培育成完整的植株，需要用______技术，该技术操作过程中除营养物质外还必须向培养基中添加______．
（6）若转基因番茄的保质期比非转基因番茄______（填“长”或“短”），则可确定转基因番茄成功．
正确答案
解：（1）以RNA为模板合成DNA的过程为逆转录，所以若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因．
（2）基因工程中改造过程需要用到的工具有限制酶、DNA连接酶和质粒，若得到的目的基因两侧需人工合成BamHⅠ黏性末端，根据BamHⅠ的识别序列，可知目的基因两侧的黏性末端为：
（3）基因转录的产物是mRNA，在转录时需要RNA聚合酶．在该基因上游加结构A可确保基因的反义转录，结构A上应具有RNA聚合酶结合位点，在该番茄新品种的培育过程中，常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞．
（4）由图可知，重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏，因此用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选．之后还需将其置于质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生．
（5）将转入反向链接PG基因的番茄细胞培育成完整的植株，需要用植物组织培养技术，该技术操作过程中除营养物质外还必须向培养基中添加植物激素即生长素和细胞分裂素．
（6）若转基因番茄的保质期比非转基因番茄长，则可确定转基因番茄成功．
故答案为：
（1）逆转录（或cDNA文库）
（2）限制酶、DNA连接酶和质粒
（3）RNA聚合 农杆菌转化法
（4）卡那霉素 是否发生质壁分离
（5）植物组织培养 植物激素
（6）长
解析
解：（1）以RNA为模板合成DNA的过程为逆转录，所以若已获取PG的mRNA，可通过逆转录法获取PG基因．
（2）基因工程中改造过程需要用到的工具有限制酶、DNA连接酶和质粒，若得到的目的基因两侧需人工合成BamHⅠ黏性末端，根据BamHⅠ的识别序列，可知目的基因两侧的黏性末端为：
（3）基因转录的产物是mRNA，在转录时需要RNA聚合酶．在该基因上游加结构A可确保基因的反义转录，结构A上应具有RNA聚合酶结合位点，在该番茄新品种的培育过程中，常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞．
（4）由图可知，重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏，因此用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有卡那霉素的培养基进行筛选．之后还需将其置于质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞是否发生质壁分离现象来鉴别细胞壁是否再生．
（5）将转入反向链接PG基因的番茄细胞培育成完整的植株，需要用植物组织培养技术，该技术操作过程中除营养物质外还必须向培养基中添加植物激素即生长素和细胞分裂素．
（6）若转基因番茄的保质期比非转基因番茄长，则可确定转基因番茄成功．
故答案为：
（1）逆转录（或cDNA文库）
（2）限制酶、DNA连接酶和质粒
（3）RNA聚合 农杆菌转化法
（4）卡那霉素 是否发生质壁分离
（5）植物组织培养 植物激素
（6）长
Rag2基因缺失小鼠不能产生成熟的淋巴细胞．科研人员利用胚胎干细胞（ES细胞）对Rag2基因缺失小鼠进行基因治疗．其技术流程如下图：
（1）步骤①中所选的卵母细胞应处于______期．
（2）步骤②中，分离出ES细胞比体细胞全能性______．
（3）步骤③中，首先要获取目的基因，以下几种方法中需要模板的是______
A．从基因组文库中获取目的基因 B．利用PCR 技术扩增目的基因
C．构建cDNA 文库 D．通过DNA 合成仪利用化学方法人工合成目的基因
（4）步骤③中，需要构建含有Rag2基因的______．
（5）为检测Rag2基因的表达情况，可提取治疗后小鼠骨髓细胞的蛋白质，用抗Rag2蛋白的抗体进行______．
正确答案
解：（1）步骤①核移植中所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中期．
（2）胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）．故步骤②中，ES细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显的特点，ES细胞比体细胞全能性高．
（3）利用PCR 技术扩增目的基因技术和构建cDNA文库都需要需要模板的．
（4）步骤③中，需要构建含有Rag2基因的基因表达载体（重组质粒），是核心环节．
（5）基因表达的产物是蛋白质，所以提取小鼠骨髓细胞的蛋白质进行抗原-抗体杂交．
故答案为：
（1）减数第二次分裂中（MⅡ中）
（2）高
（3）BC
（4）基因表达载体（重组质粒）
（5）抗原-抗体杂交
解析
解：（1）步骤①核移植中所选的卵母细胞应处于减数第二次分裂中期．
（2）胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）．故步骤②中，ES细胞在形态上表现为细胞体积小，细胞核大，核仁明显的特点，ES细胞比体细胞全能性高．
（3）利用PCR 技术扩增目的基因技术和构建cDNA文库都需要需要模板的．
（4）步骤③中，需要构建含有Rag2基因的基因表达载体（重组质粒），是核心环节．
（5）基因表达的产物是蛋白质，所以提取小鼠骨髓细胞的蛋白质进行抗原-抗体杂交．
故答案为：
（1）减数第二次分裂中（MⅡ中）
（2）高
（3）BC
（4）基因表达载体（重组质粒）
（5）抗原-抗体杂交
绿色荧光是由绿色荧光蛋白发出的，为培育能发出绿色荧光的小鼠，人们设计了如图的流程：据图回答下列问题：
（1）绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物所有基因的文库称为______．
（2）A过程是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和______，它们作用的化学键是______．一个基因表达载体的组成，除了目的基因和复制原点外，还必需有______、______以及标记基因．
（3）B过程常用的方法是______，进行D过程前，利用______技术可以获得数目更多且基因型完全相同的绿色荧光小鼠．
（4）也有人设想培育能发光的树，白天做行道树，夜晚做路灯照明．可将荧光蛋白基因导入植物的体细胞中，再利用______技术最终培育成植物体．
正确答案
解：（1）绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物所有基因的文库称为基因组文库．
（2）A过程表示基因表达载体的构建，是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键．基因表达载体的组成为目的基因+启动子+终止子+标记基因，所以用于培育绿色荧光小鼠的基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、目的基因和标记基因等部分．
（3）过程②将基因表达载体导入小鼠受精卵时，采用最多也最有效的方法是显微注射技术；过程③利用的生物技术是早期胚胎培养；在进行胚胎移植前，利用胚胎分割技术可以获得数目更多且基因型相同的绿色荧光小鼠．
（4）将荧光蛋白基因导入植物的体细胞中，需要利用植物组织培养技术培育成植物体．
故答案为：
（1）基因组文库
（2）DNA连接酶 磷酸二酯键 启动子 终止子
（3）显微注射技术 胚胎分割
（4）植物组织培养
解析
解：（1）绿色荧光基因通常可以从基因文库中获取，含有一种生物所有基因的文库称为基因组文库．
（2）A过程表示基因表达载体的构建，是基因工程的核心，常用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键．基因表达载体的组成为目的基因+启动子+终止子+标记基因，所以用于培育绿色荧光小鼠的基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、目的基因和标记基因等部分．
（3）过程②将基因表达载体导入小鼠受精卵时，采用最多也最有效的方法是显微注射技术；过程③利用的生物技术是早期胚胎培养；在进行胚胎移植前，利用胚胎分割技术可以获得数目更多且基因型相同的绿色荧光小鼠．
（4）将荧光蛋白基因导入植物的体细胞中，需要利用植物组织培养技术培育成植物体．
故答案为：
（1）基因组文库
（2）DNA连接酶 磷酸二酯键 启动子 终止子
（3）显微注射技术 胚胎分割
（4）植物组织培养
苏云金杆菌是一种对昆虫有毒害作用的细菌，其杀虫活性物质主要是一类伴孢晶体蛋白．伴孢晶体蛋白经昆虫肠液消化成毒性肽，并因此导致昆虫死亡．自1993 年培育转基因植物抗虫棉成功后，研究者又将抗虫基因成功地导入水稻细胞中．在培育转基因植物的研究中，抗除草基因（har）常作为标记基因．这样培育出来的转基因水稻既能抗虫又能抗除草剂，便于田间管理．下图为获得转基因水稻的技术流程，请据图回答：
（1）水稻细胞的基因结构与苏云金杆菌有所不同，其主要特点是______．
（2）要获得该抗虫基因，可采用______、______等方法．
（3）假如运载体被切割后，得到的分子末端序列为______，则能与该运载体连接的抗虫基因分子末端序列是______．
（4）C 过程的水稻细胞经过______形成愈伤组织．培养基中除了含有必要营养物质，琼脂和激素外，还必须加入______．该培养基从用途上看属于______．
（5）如果抗虫基因在水稻细胞中成功表达，请用中心法则形式表示该基因的表达过程．
（6）种植上述转基因植物，它所携带的目的基因可能通过花粉传递给近缘物种，造成“基因污染”．如果把目的基因导入叶绿体DNA 中，就可以避免“基因污染”，原因是______．
正确答案
解：（1）水稻细胞属于真核细胞，苏云金杆菌细胞属于原核细胞，真核基因结构和原核基因结构有所不同，原核基因的编码区是间隔、不连续的．
（2）获取目的基因的方法一般可以从基因文库中直接获取，或者利用人工合成的方法．
（3）目的基因和运载体重组时必须具有相同的粘性末端，然后用DNA连接酶进行连接．
（4）图中C表示脱分化过程．培养基中除了含有必要营养物质，琼脂和激素外，还必须加入除草剂．该培养基从用途上看属于选择培养基．
（5）抗虫基因在水稻细胞中表达过程为：抗虫基因
（6）叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过叶绿体传递给近缘物种，因此如果把目的基因导入叶绿体DNA 中，就可以避免“基因污染”．
故答案为：
（1）基因编码区是间隔、不连续的
（2）从基因文库中获取或人工合成基因
（3）
（4）脱分化 除草剂 选择培养基
（5）抗虫基因
（6）叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过叶绿体传递给近缘物种
解析
解：（1）水稻细胞属于真核细胞，苏云金杆菌细胞属于原核细胞，真核基因结构和原核基因结构有所不同，原核基因的编码区是间隔、不连续的．
（2）获取目的基因的方法一般可以从基因文库中直接获取，或者利用人工合成的方法．
（3）目的基因和运载体重组时必须具有相同的粘性末端，然后用DNA连接酶进行连接．
（4）图中C表示脱分化过程．培养基中除了含有必要营养物质，琼脂和激素外，还必须加入除草剂．该培养基从用途上看属于选择培养基．
（5）抗虫基因在水稻细胞中表达过程为：抗虫基因
（6）叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过叶绿体传递给近缘物种，因此如果把目的基因导入叶绿体DNA 中，就可以避免“基因污染”．
故答案为：
（1）基因编码区是间隔、不连续的
（2）从基因文库中获取或人工合成基因
（3）
（4）脱分化 除草剂 选择培养基
（5）抗虫基因
（6）叶绿体遗传表现为母系遗传，目的基因不会通过叶绿体传递给近缘物种
组织型纤溶酶原激活剂（tPA）在人体纤溶和凝血的平衡凋节中发挥着关键性的作用，科研人员现在能利用转基因奶牛的乳汁生产组织型纤溶酶原激活剂（tPA）．回答下列相关问题：
（1）为了获得更多的tPA基因，可对其进行体外“克隆”，该技术指的是______技术．
（2）在构建的基因表达载体中，应将tPA基因首端与______基因的启动子等调控组件结合．将目的基因导入动物细胞常用的方法是______．
（3）在培育转基因奶牛的过程中，应取囊胚的滋养层细胞进行______鉴定，选用雌性胚胎，通过______技术，将早期胚胎移入代孕母牛的子宫内．从个体水平上看，若______，则可确定转基因牛培育成功．
（4）若从囊胚的内细胞团可分离出ES细胞，培养ES细胞时，培养液中加入______，可以分化为不同类型的细胞．
正确答案
解：（1）基因工程中，在体外扩增目的基因常利用PCR技术．
（2）要利用奶牛乳汁生产组织型纤溶酶原激活剂（tPA），在构建的基因表达载体中，应将tPA基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件结合，使目的基因在乳腺组织中特异性表达．将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法．
（3）在培育转基因奶牛的过程中，奶牛必须是雌性的，应取囊胚的滋养层细胞进行性别鉴定，选用雌性胚胎，通过胚胎移植技术，将早期胚胎移入代孕母牛的子宫内．从个体水平上看，若转基因牛的乳汁中产生组织型纤溶酶原激活剂，则可确定转基因牛培育成功．
（4）若从囊胚的内细胞团可分离出ES细胞，培养ES细胞时，培养液中加入分化诱导因子，可以分化为不同类型的细胞．
故答案为：
（1）PCR
（2）乳腺蛋白 显微注射法
（3）性别 胚胎移植 转基因牛的乳汁中产生组织型纤溶酶原激活剂
（4）分化诱导因子
解析
解：（1）基因工程中，在体外扩增目的基因常利用PCR技术．
（2）要利用奶牛乳汁生产组织型纤溶酶原激活剂（tPA），在构建的基因表达载体中，应将tPA基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件结合，使目的基因在乳腺组织中特异性表达．将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法．
（3）在培育转基因奶牛的过程中，奶牛必须是雌性的，应取囊胚的滋养层细胞进行性别鉴定，选用雌性胚胎，通过胚胎移植技术，将早期胚胎移入代孕母牛的子宫内．从个体水平上看，若转基因牛的乳汁中产生组织型纤溶酶原激活剂，则可确定转基因牛培育成功．
（4）若从囊胚的内细胞团可分离出ES细胞，培养ES细胞时，培养液中加入分化诱导因子，可以分化为不同类型的细胞．
故答案为：
（1）PCR
（2）乳腺蛋白 显微注射法
（3）性别 胚胎移植 转基因牛的乳汁中产生组织型纤溶酶原激活剂
（4）分化诱导因子
请回答下列有关现代生物技术的问题：
（1）拟南芥的A基因位于1号染色体上，影响减数分裂时染色体交换频率，a基因无此功能；a基因是科学家通过将T-DNA插入到A基因中获得的，用PCR法确定T-DNA插入的位置时，应从图中选择的引物组合是______．
（2）设计引物是PCR技术的关键步骤之一．某科研小组设计的两组引物（只标记了部分碱基序列）都不合理（如图），请说明原因．
①第1组：______．
②第2组：______．
（3）动物细胞培养是动物细胞工程的基础．利用生物反应器培养动物细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制．通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以______，增加培养细胞的数量，也有利于空气交换．
（4）哺乳动物的胚胎干细胞，可以用______处理囊胚的内细胞团获得，也可以从胎儿的原始生殖腺中分离，随后在______细胞上（或紫外线照射后的成纤维细胞）或加入抑制因子可实现只增殖而不分化，用于治疗人类的组织损伤和某些顽症，也可用于器官移植．
（5）一般来说，生态工程的主要任务是对______进行修复，对造成环境污染和破坏的生产方式进行改善，并提高生态系统的生产力．生态工程所遵循的基本原理有整体性、协调与平衡、系统学和工程学、物质循环再生和______原理等．
正确答案
解：（1）引物Ⅰ和Ⅲ延伸的方向向左，引物Ⅱ引物延伸的方向向右，引物组合只能是Ⅰ和Ⅱ，或Ⅱ和Ⅲ．扩增T-DNA插入位置，应该是扩增包括T-DNA和两侧A基因片段．故选引物Ⅱ和Ⅲ．
（2）两组引物（只标记了部分碱基序列）都不合理的原因：
①第1组：引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效．
②第2组：引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效．
（3）利用生物反应器培养动物细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制．通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以扩大细胞贴壁生长的附着面积，增加培养细胞的数量，也有利于空气交换．
（4）胚胎干细胞来自原始性腺和早期胚胎（如囊胚的内细胞细胞），因此要获取单个胚胎干细胞可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理囊胚的内细胞，也可以从胎儿的原始生殖腺中分离；胚胎干细胞在饲养层细胞上（或紫外线照射后的成纤维细胞）或加入抑制因子时可实现只增殖而不分化，用于治疗人类的组织损伤和某些顽症，也可用于器官移植．
（5）一般来说，生态工程的主要任务是对已被破坏的生态环境（或受损的生态系统）进行修复，对造成环境污染和破坏的生产方式进行改善，并提高生态系统的生产力．生态工程所遵循的基本原理有整体性、协调与平衡、系统学和工程学、物质循环再生和物种多样性原理等．
故答案为：
（1）Ⅱ和Ⅲ
（2）①引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效
②引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
（3）扩大细胞贴壁生长的附着面积
（4）蛋白酶/胶原蛋白酶 饲养层
（5）已被破坏的生态环境（或受损的生态系统） 物种多样性
解析
解：（1）引物Ⅰ和Ⅲ延伸的方向向左，引物Ⅱ引物延伸的方向向右，引物组合只能是Ⅰ和Ⅱ，或Ⅱ和Ⅲ．扩增T-DNA插入位置，应该是扩增包括T-DNA和两侧A基因片段．故选引物Ⅱ和Ⅲ．
（2）两组引物（只标记了部分碱基序列）都不合理的原因：
①第1组：引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效．
②第2组：引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效．
（3）利用生物反应器培养动物细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制．通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以扩大细胞贴壁生长的附着面积，增加培养细胞的数量，也有利于空气交换．
（4）胚胎干细胞来自原始性腺和早期胚胎（如囊胚的内细胞细胞），因此要获取单个胚胎干细胞可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理囊胚的内细胞，也可以从胎儿的原始生殖腺中分离；胚胎干细胞在饲养层细胞上（或紫外线照射后的成纤维细胞）或加入抑制因子时可实现只增殖而不分化，用于治疗人类的组织损伤和某些顽症，也可用于器官移植．
（5）一般来说，生态工程的主要任务是对已被破坏的生态环境（或受损的生态系统）进行修复，对造成环境污染和破坏的生产方式进行改善，并提高生态系统的生产力．生态工程所遵循的基本原理有整体性、协调与平衡、系统学和工程学、物质循环再生和物种多样性原理等．
故答案为：
（1）Ⅱ和Ⅲ
（2）①引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效
②引物I′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
（3）扩大细胞贴壁生长的附着面积
（4）蛋白酶/胶原蛋白酶 饲养层
（5）已被破坏的生态环境（或受损的生态系统） 物种多样性
如图是利用基因工程技术产生人胰岛素的操作过程示意图，请据图回答：
（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？______，原因是______．
（2）过程②必须的酶是______，过程③必须的酶是______，过程⑦中将A、B连接时必须的酶是______．
（3）图中C的组成包括______、______、______、______和复制原点
（4）为使过程⑧更易进行可用______药剂处理D．
正确答案
解：（1）由于在细胞分化过程中，基因是选择性表达的，所以人的皮肤细胞中不转录出胰岛素mRNA，因而不能利用人的皮肤细胞来完成①过程．
（2）过程②以RNA为模板进行逆转录，所以必须的酶是逆转录酶．过程③是将DNA双链解开，形成两条单链，所以必须的酶是解旋酶．过程⑦是构建基因表达载体，其过程中将A、B连接时必须的酶是DNA连接酶．
（3）图中C为基因表达载体，其组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点．
（4）为使过程⑧更易进行可用CaCl2药剂处理D，使其成为感受态细菌．
故答案为：
（1）不能 基因是选择性表达的，人的皮肤细胞中不转录出胰岛素mRNA
（2）逆转录酶 解旋酶 DNA连接酶
（3）目的基因 标记基因 启动子 终止子
（4）CaCl2
解析
解：（1）由于在细胞分化过程中，基因是选择性表达的，所以人的皮肤细胞中不转录出胰岛素mRNA，因而不能利用人的皮肤细胞来完成①过程．
（2）过程②以RNA为模板进行逆转录，所以必须的酶是逆转录酶．过程③是将DNA双链解开，形成两条单链，所以必须的酶是解旋酶．过程⑦是构建基因表达载体，其过程中将A、B连接时必须的酶是DNA连接酶．
（3）图中C为基因表达载体，其组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点．
（4）为使过程⑧更易进行可用CaCl2药剂处理D，使其成为感受态细菌．
故答案为：
（1）不能 基因是选择性表达的，人的皮肤细胞中不转录出胰岛素mRNA
（2）逆转录酶 解旋酶 DNA连接酶
（3）目的基因 标记基因 启动子 终止子
（4）CaCl2
普通牛奶赖氨酸含量低，为了提高牛奶中赖氨酸的含量，吉林大学农学部利用现代生物工程技术培育出世界首例赖氨酸转基因克隆奶牛“织女”，预计将来其分泌的乳汁中含有更多的赖氨酸．如图为培育转基因克隆动物的技术流程图，请回答：
（1）获得黑白花奶牛成纤维细胞后，利用技术扩增细胞．“织女”牛⑦进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产人类所需的赖氨酸，因而称为______．
（2）实施基因工程的核心操作步骤是______，实现②过程的常用方法是______．
（3）在目的基因的检测与鉴定过程中，检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是______．
（4）获得重组细胞④时，以去核卵细胞为受体细胞的原因是______．
正确答案
解：（1）“织女”牛⑦进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产人类所需的赖氨酸，因而称为动物细胞培养乳腺（房）生物反应器．
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是纤维注射法．
（3）检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是采用分子杂交技术检测目的基因是否转录出了mRNA．
（4）由于卵细胞体积大、易操作，且含有促进细胞核全能性表达的物质和营养条件，因此获得重组细胞④时，需以去核卵细胞为受体细胞．
故答案为：
（1）动物细胞培养乳腺（房）生物反应器
（2）基因表达载体的构建显微注射技术
（3）检测目的基因是否转录出了mRNA
（4）卵细胞体积大、易操作，含有促进细胞核全能性表达的物质和营养条件
解析
解：（1）“织女”牛⑦进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产人类所需的赖氨酸，因而称为动物细胞培养乳腺（房）生物反应器．
（2）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是纤维注射法．
（3）检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是采用分子杂交技术检测目的基因是否转录出了mRNA．
（4）由于卵细胞体积大、易操作，且含有促进细胞核全能性表达的物质和营养条件，因此获得重组细胞④时，需以去核卵细胞为受体细胞．
故答案为：
（1）动物细胞培养乳腺（房）生物反应器
（2）基因表达载体的构建显微注射技术
（3）检测目的基因是否转录出了mRNA
（4）卵细胞体积大、易操作，含有促进细胞核全能性表达的物质和营养条件
科学家从深海鱼体内发现一种抗冻蛋白基因afp，能对农作物的抗寒能力进行改造．进一步研究发现，该抗冻蛋白中某段氨基酸序列重复次数越多，抗寒能力越强，科学家对afp进行改造后得到safp基因，并用该基因对棉花进行改造，过程如下：
（1）获得safp基因后，为了保障实验需求，通常利用______技术获得大量safp基因的拷贝．
（2）构建重组质粒后，要先将其导入农杆菌，需要用______处理农杆菌，完成转化后再进而导入棉花细胞，这种转化法称为______法．
（3）将重组质粒导入棉花细胞时，需要将转化后的农杆菌与棉花愈伤组织混合培养，再通过______检测、筛选导入safp基因的棉花细胞；并进一步用______检测、筛选safp基因表达成功的棉花细胞；最后还要通过个体水平鉴定，才能确认改造成功．
（4）最后，通过个体水平的鉴定，科学家确定safp基因成功整合到棉花细胞中的某个染色体上，从而得到一株抗寒棉花植株，使其自交，则后代中抗寒：非抗寒=______．
（5）从获得afp基因到得到抗寒棉花植株，该过程应用的工程技术有______（至少写出两项）．
正确答案
解：（1）获得safp基因后，为了保障实验需求，通常利用PCR技术获得大量safp基因的拷贝．PCR技术的原理是DNA复制，需要的材料与条件有：模板DNA、热稳定DNA聚合酶、引物、原料等．
（2）构建重组质粒后，要先将其导入农杆菌，需要用钙离子处理农杆菌，使之成为感受态．完成转化后再通过农杆菌转化法导入棉花细胞．
（3）将重组质粒导入棉花细胞时，需要将转化后的农杆菌与棉花愈伤组织混合培养，再通过DNA分子杂交技术检测、筛选导入safp基因的棉花细胞；并进一步用抗原-抗体杂交技术检测、筛选safp基因表达成功的棉花细胞；最后还要通过个体水平鉴定，才能确认改造成功．
（4）如果safp基因成功整合到棉花细胞中的某个染色体上，得到的抗寒棉花植株相当于杂合体，则其自交后代中抗寒：非抗寒=3：1．
（5）从获得afp基因到得到抗寒棉花植株，该过程应用的工程技术有基因工程、植物组织培养等．
故答案为：
（1）PCR（DNA扩增）
（2）钙离子 农杆菌转化
（3）DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术
（4）3：1
（5）基因工程、植物组织培养
解析
解：（1）获得safp基因后，为了保障实验需求，通常利用PCR技术获得大量safp基因的拷贝．PCR技术的原理是DNA复制，需要的材料与条件有：模板DNA、热稳定DNA聚合酶、引物、原料等．
（2）构建重组质粒后，要先将其导入农杆菌，需要用钙离子处理农杆菌，使之成为感受态．完成转化后再通过农杆菌转化法导入棉花细胞．
（3）将重组质粒导入棉花细胞时，需要将转化后的农杆菌与棉花愈伤组织混合培养，再通过DNA分子杂交技术检测、筛选导入safp基因的棉花细胞；并进一步用抗原-抗体杂交技术检测、筛选safp基因表达成功的棉花细胞；最后还要通过个体水平鉴定，才能确认改造成功．
（4）如果safp基因成功整合到棉花细胞中的某个染色体上，得到的抗寒棉花植株相当于杂合体，则其自交后代中抗寒：非抗寒=3：1．
（5）从获得afp基因到得到抗寒棉花植株，该过程应用的工程技术有基因工程、植物组织培养等．
故答案为：
（1）PCR（DNA扩增）
（2）钙离子 农杆菌转化
（3）DNA分子杂交技术 抗原-抗体杂交技术
（4）3：1
（5）基因工程、植物组织培养
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